香樟葉揮發(fā)油的止癢作用研究

楊錦強(qiáng)，楊念云

（南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京 210023）

香樟葉揮發(fā)油含有多種成分主要為芳樟醇，樟腦，石竹烯，桉葉油醇等成分[1]。香樟葉揮發(fā)油具有抑菌作用[2-4]，但止癢效果和具體的作用機(jī)制近年來卻少見于文獻(xiàn)報道。目前，皮膚瘙癢癥狀在臨床上非常常見，常用糖皮質(zhì)激素類藥物來治療各種皮膚病，但不良反應(yīng)明顯[5]。中華本草認(rèn)為香樟具有止癢功效，本實驗將香樟葉揮發(fā)油應(yīng)用于皮膚瘙癢的治療，為應(yīng)用于臨床做基礎(chǔ)性研究。采用4-氨基吡啶瘙癢模型[6-8]和2，4-二硝基氟苯變態(tài)反應(yīng)性接觸性皮炎模型[9]來觀察香樟葉揮發(fā)油對皮膚瘙癢的止癢作用，觀察其對局部組織的作用，運(yùn)用血清酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）方法觀察其對幾種與瘙癢相關(guān)的細(xì)胞因子的影響，以期闡明香樟葉揮發(fā)油的止癢機(jī)制。

1 材料

1.1 實驗動物 ICR小鼠64只SPF級，體質(zhì)量20～22 g，由南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場提供（動物合格證號：NO201725010），實驗前動物在SPF級飼養(yǎng)室飼養(yǎng)3d后用于實驗，飼養(yǎng)室室溫20～25℃，相對濕度40%～60%。

1.2 實驗藥品和儀器 香樟葉于2017年9月份采自南京中醫(yī)藥大學(xué)校園內(nèi)，所有樣品均經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)楊念云副研究員鑒定，標(biāo)本保存于南京中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)實驗室。栗米油，復(fù)方地塞米松乳膏（三九醫(yī)藥股份有限公司，批號44024170），地塞米松片（浙江仙據(jù)制藥股份有限公司批號170239），4-氨基吡啶（梯希愛化工合成發(fā)展有限公司），2，4-二硝基氟苯（麥克林公司，批號C10104378），小鼠血清5-羥色胺（5-HT）測定試劑盒，白細(xì)胞介素-4（IL-4）測定試劑盒，白三烯B4（LTB4）試劑盒均購于上海源葉生物有限公司。

TGL-16C臺式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；FA1204B分析天平，上海精科天美儀器有限公司。

2 實驗方法

2.1 香樟葉揮發(fā)油的提取 稱取500 g香樟葉（經(jīng)粉碎），置于圓底燒瓶中，水蒸氣蒸餾2 h，揮發(fā)油得率為 1．72%（V/W），具有特殊香味。

2.2 4 -氨基吡啶致小鼠瘙癢實驗

2.2.1 實驗動物分組 ICR雌性小鼠32只，隨機(jī)分成4組，每組8只。分別是：模型組、陽性對照組（復(fù)方地塞米松乳膏）、揮發(fā)油溶液高劑量組（體積分?jǐn)?shù)80%）、揮發(fā)油溶液低劑量組（體積分?jǐn)?shù)20%），揮發(fā)油用栗米油配制成溶液。

2.2.2 實驗動物建模與給藥方法 在各組小鼠的頸背部脫毛，面積為2 cm×3 cm，24 h后給藥。模型組的脫毛區(qū)涂栗米油2．5 mL/kg，高劑量組的脫毛區(qū)涂2．5 mL/kg濃度為80%的揮發(fā)油溶液，低劑量組的脫毛區(qū)涂2．5 mL/kg濃度為20%的揮發(fā)油溶液，陽性對照組的脫毛區(qū)涂復(fù)方地塞米松乳膏20 g/kg。給藥30 min以后，在所有小鼠的頸背部皮下注射4-氨基吡啶溶液1 mL/kg（4-氨基吡啶先用生理鹽水配制成0．5%的溶液，實驗前再用生理鹽水將其稀釋成 0．01%的溶液）。

2.2.3 實驗動物的舔體反應(yīng)次數(shù)、生化指標(biāo)的測定和組織樣品的觀察 在小鼠的頸背部皮下注射4-氨基吡啶溶液后，立即觀察小鼠在10 min內(nèi)的舔體次數(shù)，10 min后，將小鼠摘眼球取血，將血液靜置冰浴10 min，離心機(jī)3 000 r/min離心30 min，吸取上清液，-20℃保存，采用各試劑盒的給定方法，每個樣本平行測定2次，分別測定血漿中的5-HT、IL-4和LTB4的含量。

取完血后，通過后頸椎脫臼的方式處死小鼠，取注射部位的皮膚（1 cm×1 cm）一塊，用福爾馬林浸泡、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅（HE）染色，用顯微鏡觀察注射部位周圍的真皮組織變化。

2.3 2 ，4-二硝基氟苯致小鼠變態(tài)反應(yīng)性接觸性皮炎實驗

2.3.1 實驗動物分組 ICR雌性小鼠32只，隨機(jī)分成4組，每組8只。分別是：模型組、陽性對照組（地塞米松3．25 mg/mL）、揮發(fā)油溶液高劑量組（體積分?jǐn)?shù)5%）、揮發(fā)油溶液低劑量組（體積分?jǐn)?shù)1．25%），揮發(fā)油用栗米油配制，地塞米松研磨成粉末后也用栗米油配成混懸液。

2.3.2 實驗動物建模與給藥方法 在小鼠腹部脫毛，面積為3 cm×3 cm，24 h后給藥。第1天，模型組灌服20 mL/kg的栗米油，高劑量組灌服20 mL/kg濃度為5%的揮發(fā)油溶液，低劑量組灌服20 mL/kg濃度為1．25%的揮發(fā)油溶液，陽性對照組灌服20 ml/kg濃度為3．25 mg/mL的地塞米松混懸液。灌胃給藥每天1次，連續(xù)5 d，再于第7天誘發(fā)前2 h給藥1次。第 2天（致敏期）在脫毛區(qū)外涂 25 μL 0．5%的 2，4-二硝基氟苯溶液（丙酮配制）致敏。第7天（誘發(fā)期）在小鼠的左耳每面外涂5 μL 0．5%的2，4-二硝基氟苯溶液誘發(fā)皮炎。

2.3.3 實驗動物生化指標(biāo)的測定 各組小鼠于誘發(fā)后48 h，將小鼠摘眼球取血，將血液靜置冰浴10 min，離心機(jī)3 000 r/min離心30 min，吸取上清液，-20℃保存，采用各試劑盒的給定方法，每個樣本平行測定兩次，分別測定血漿中的IL-4和LTB4的含量。

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19．0統(tǒng)計軟件分析，實驗數(shù)據(jù)以標(biāo)數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0．05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 舔體反應(yīng)實驗結(jié)果 與模型組相比，香樟葉揮發(fā)油高、低劑量組10 min內(nèi)舔體次數(shù)均顯著減少（P＜0．01），表明香樟葉揮發(fā)油具有顯著的止癢功效，結(jié)果見表1。

表1 香樟葉揮發(fā)油對舔體反應(yīng)的影響（±s）Tab.1 Effects of essential oil of Cinnamomum camphora leaves on lick reaction(±s)

表1 香樟葉揮發(fā)油對舔體反應(yīng)的影響（±s）Tab.1 Effects of essential oil of Cinnamomum camphora leaves on lick reaction(±s)

注：與模型組比較，**P＜0．01。

組別模型組香樟葉揮發(fā)油高劑量組香樟葉揮發(fā)油低劑量組陽性對照組動物數(shù)8 8 8 8濃度（%） 舔體次數(shù)（次）—29．88±3．00 80 9．63±1．51**20 17．5±2．14**0．1 21．88±2．47**

3.2 血清ELISA檢測結(jié)果 4-氨基吡啶瘙癢模型中按血清ELISA檢測試劑盒說明書要求分別檢測小鼠血清中5-HT，LTB4，IL-4的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)香樟葉揮發(fā)油高劑量組及陽性對照組小鼠血清中5-HT 和 LTB4的濃度顯著降低（P＜0．05），但香樟葉揮發(fā)油高、低劑量組及陽性對照組對IL-4的影響均無顯著性影響（P＞0．05），結(jié)果見表 2。

2，4-二硝基氟苯變態(tài)反應(yīng)性接觸性皮炎模型中按血清ELISA檢測試劑盒說明書要求分別檢測小鼠血清中LTB4，IL-4的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)香樟葉揮發(fā)油高劑量組及陽性對照組小鼠血清中LTB4的濃度顯著降低（P＜0．05），但香樟葉揮發(fā)油高、低劑量組及陽性對照組對IL-4的影響均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05），結(jié)果見表 3。

表2 香樟葉揮發(fā)油對4-氨基吡啶瘙癢模型血清生化指標(biāo)的影響（±s）Tab.2 Effects of essential oil of Cinnamomum camphora leaves on serum biochemical indicators in the model of pruritus induced by 4-aminopyridine(±s)

表2 香樟葉揮發(fā)油對4-氨基吡啶瘙癢模型血清生化指標(biāo)的影響（±s）Tab.2 Effects of essential oil of Cinnamomum camphora leaves on serum biochemical indicators in the model of pruritus induced by 4-aminopyridine(±s)

注：與模型組比較，*P＜0．05。

組別模型組香樟葉揮發(fā)油高劑量組香樟葉揮發(fā)油低劑量組陽性對照組動物數(shù)8 8 8 8濃度（%） 5-HT（ng/mL） LTB4（pg/mL） IL-4（pg/mL）—81．76±3．74 50．65±4．51 17．56±1．18 80 76．10±3．42* 44．59±2．22* 16．64±4．16 20 78．99±1．72 47．86±3．25 18．31±2．31 0．1 75．16±5．17* 44．76±3．23* 18．31±2．12

表3 香樟葉揮發(fā)油對2，4-二硝基氟苯變態(tài)反應(yīng)性接觸性皮炎模型血清生化指標(biāo)的影響（x±s）Tab.3 Effects of essential oil of Cinnamomum camphora leaves on serum biochemical indicators in the model of allergic contact dermatitis induced by 2，4-dinitrofluorobenzene(±s)

表3 香樟葉揮發(fā)油對2，4-二硝基氟苯變態(tài)反應(yīng)性接觸性皮炎模型血清生化指標(biāo)的影響（x±s）Tab.3 Effects of essential oil of Cinnamomum camphora leaves on serum biochemical indicators in the model of allergic contact dermatitis induced by 2，4-dinitrofluorobenzene(±s)

注：與模型組比較，*P＜0．05。

組別模型組香樟葉揮發(fā)油高劑量組香樟葉揮發(fā)油低劑量組陽性對照組動物數(shù)8 8 8 8濃度（%）LTB4（pg/mL）IL-4（pg/mL）— 47．16±2．66 20．84±1．54 2．5 43．99±2．87* 19．91±1．40 1．25 46．39±1．95 18．99±2．06 3．25 43．50±2．40* 20．39±4．54

3.3 HE染色鏡下觀察結(jié)果 在香樟葉揮發(fā)油對于4-氨基吡啶瘙癢模型止癢作用的研究中病理檢查顯示模型組皮膚真皮層輕度水腫，大量炎細(xì)胞，香樟葉揮發(fā)油高劑量組和陽性藥組未觀察到異常，香樟葉揮發(fā)油低劑量組真皮層輕度增厚，結(jié)果見圖1。結(jié)合舔體實驗結(jié)果可以推測香樟葉揮發(fā)油高、低劑量組和陽性藥對照組對4-氨基吡啶瘙癢模型出現(xiàn)的急性炎癥反應(yīng)有一定的抑制作用。

4 討論

瘙癢是一種能引起搔抓欲望的主觀感覺。癢覺感受器存在于真皮與表皮連接處的感覺神經(jīng)游離末梢，這些感受器可以特異性結(jié)合致癢因子，即瘍癢的傳導(dǎo)介質(zhì)莊要包括胺類、蛋白酶、生長因子、神經(jīng)肚、類阿片物質(zhì)、二十烷類細(xì)胞素等。這些傳導(dǎo)介質(zhì)常表達(dá)于不同的皮膚細(xì)胞，如角質(zhì)細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞，不同的癢覺感受器與不同的致癢因子特異結(jié)合后，傳遞沖動產(chǎn)生痰癢[10]。當(dāng)被致癢因子刺激后，一種特異的C纖維將沖動傳至脊髓的背側(cè)角，然后通過脊髓丘腦束至丘腦的板層核，最后到達(dá)大腦皮層(軀體感覺區(qū))，進(jìn)而產(chǎn)生搔抓反射[11]。本實驗通過局部注射致癢物質(zhì)建立痰癢動物模型，屬感受性瘙癢。并通過瘙癢程度比較用不同致癢物質(zhì)以及不同建立方法建立的瘙癢。很多皮膚病都可產(chǎn)生瘙癢癥狀，常見的有過敏性皮膚病、特應(yīng)性皮炎、皰類皮膚病等，相同的致癢介質(zhì)在不同疾病瘙癢的發(fā)生中發(fā)揮的作用可能不同，在同一疾病發(fā)展的不同階段中可能有不同的介質(zhì)參與瘙癢的發(fā)生[12]。日常生活中蚊蟲叮咬、疥蟲寄生等也會引起皮膚瘙癢。目前暫時還沒有特異性的止癢治療方法，通過活性藥物拮抗瘙癢介質(zhì)是最有希望的止癢策略[13]。4-氨基吡啶是一種鉀通道阻滯劑同時也具有促肥大細(xì)胞釋放組胺的作用，組胺是人們最早發(fā)現(xiàn)的瘙癢介質(zhì)之一在許多過敏性疾病的動物模型建立中都有廣泛的應(yīng)用[8]。2，4-二硝基氟苯雖不能直接致癢，但是在很多考察瘙癢機(jī)制或藥物的止癢活性中可用其建立變態(tài)反應(yīng)性接觸性皮炎模型進(jìn)行研究。反復(fù)將2，4-硝基氟苯應(yīng)用于小鼠耳上，會導(dǎo)致小鼠耳腫脹，血清特異性IgE水平升高[14]。5-HT是一種在皮膚瘙癢癥及其他瘙癢性疾病中起重要作用的介導(dǎo)物質(zhì)，在人類及鼠類均能引發(fā)顯著的瘙癢反應(yīng)[12]。LTB4是一個強(qiáng)有效的炎癥介質(zhì)，目前推測LTB4可能的致癢機(jī)制為通過致敏皮膚的C類神經(jīng)纖維的傷害感受器而直接作用于皮膚感受傷害的無髓鞘的C類神經(jīng)纖維末梢，而癢的傳導(dǎo)正是由這一類纖維介導(dǎo)的和作用于白細(xì)胞或皮膚的其它細(xì)胞而釋放致癢介質(zhì)[15]。

圖1 HE染色結(jié)果Fig.1 Results of HE staining

本研究結(jié)果表明，香樟葉揮發(fā)油能抑制4-氨基吡啶和2，4-二硝基氟苯引起的瘙癢，從血清ELISA檢測的結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，薄香樟葉揮發(fā)油對小鼠的血清LTB4，5-HT濃度有顯著的減少，但香樟葉揮發(fā)油對血清IL-4無顯著的影響。結(jié)合病理切片的結(jié)果來看，表明香樟葉揮發(fā)油具有顯著的止癢作用，其機(jī)制為影響一些相關(guān)因子發(fā)揮作用。香樟葉揮發(fā)油的止癢作用與其化學(xué)成分的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。