中藥復(fù)方熄風膠囊對氯化鋰-匹羅卡品致癇大鼠海馬電壓門控性Ⅰ型鈉通道α亞基蛋白表達的影響*

路巖莉，房艷艷，李新民，孫 丹，晉 黎，韓耀巍

（1．天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院兒科，天津 300193；2．山東省臨沂市中醫(yī)醫(yī)院兒科，臨沂 276002）

藥物難治性癲癇是目前兒科神經(jīng)領(lǐng)域的研究熱點，其中抗癲癇藥物（AEDs）作用靶點發(fā)生結(jié)構(gòu)或功能改變是導(dǎo)致藥物難治的原因之一。目前研究較多的作用靶點是電壓門控性鈉離子通道，主要在可興奮性細胞中表達，其結(jié)構(gòu)和功能異?？梢鹕窠?jīng)元的膜興奮性改變，參與癲癇的發(fā)病機制，尤其是Ⅰ型電壓門控性鈉通道（Na1．1）最為重要。實驗將從氯化鋰—匹羅卡品致癇大鼠海馬Na1．1的表達入手，觀察中藥復(fù)方制劑熄風膠囊對其影響。

1 材料

1.1 動物 SPF級健康雄性SD大鼠45只，體質(zhì)量（45±10）g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后開始實驗。

1.2 藥品 氯化鋰（批號為115K1308，每瓶100 g，美國Sigma公司）、鹽酸匹羅卡品（批號為066k1730，5 g/瓶，美國Sigma公司）、熄風膠囊[院內(nèi)制劑，藥物組成：紫河車、石菖蒲、天麻、川芎、全蝎、白僵蠶、蜈蚣、白礬、郁金等，批號為津藥制字（2001）Z第0252號，每粒0．33 g，天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院杏林藥廠]等。

2 實驗動物的分組及處理

2.1 造模 將45只大鼠隨機分成兩組，空白組6只，其余39只用于模型的建立。腹腔注射氯化鋰（127 mg/kg），18 h后腹腔注射硫酸阿托品（1 mg/kg）以減少外周膽堿能作用，30 min后腹腔注射匹羅卡品（濃度1%，首次 20 mg/kg，30 min后 10 mg/kg），大鼠出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)（SE）1 h后，再給予腹腔注射地西泮（10 mg/kg）解除抽搐，如癇性發(fā)作不能緩解，可重復(fù)注射地西泮1～2次，直到癇性發(fā)作被解除。

驚厥評分采用Racine評分法[1]。0級：無反應(yīng)；Ⅰ級：耳、面部抽搐；Ⅱ級：肌陣攣，但無直立位；Ⅲ級：肌陣攣，伴直立位；Ⅳ級：全身強直-陣攣發(fā)作；Ⅴ級：全身強直-陣攣發(fā)作，并失去體位控制。癇性發(fā)作達到Ⅳ及以上，解除發(fā)作后狀態(tài)良好的大鼠為合格致癇大鼠模型。

2.2 分組 35只造模成功的大鼠隨機選擇24只，按每組6只隨機分成4組：模型對照組（模型組）、熄風膠囊低劑量治療組（熄低組）、熄風膠囊中劑量治療組（熄中組）、熄風膠囊高劑量治療組（熄高組）。

2.3 處理 熄低組、熄中組和熄高組大鼠，分別每天上午灌胃熄風膠囊 0．33、0．66 和 0．99 g 濃縮劑，每次2 mL，模型組和空白組大鼠，分別每天上午灌胃生理鹽水1次，每次2 mL。共持續(xù)60 d。

3 免疫組化實驗

3.1 標本制備 致癇大鼠10%水合氯醛麻醉，心臟內(nèi)快速推注250 mL生理鹽水灌洗液至肝臟變?yōu)橥咙S色，待右心流出清亮液體時，4%250 mL冷多聚甲醛磷酸緩沖液灌注至大鼠全身肌肉逐漸僵硬、強直，即斷頭、取腦，置于冰盤上4%戊二醛固定液中剝離腦組織，將含有雙側(cè)海馬的腦組織固定于4%多聚甲醛緩沖液中。

3.2 標本檢測 石蠟切片脫蠟至水。蒸餾水沖洗，磷酸鹽緩沖液（PBS）浸泡5 min。切片放入92～98℃的 500 mL 0．01 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉溶液中反應(yīng)15 min后，自然冷卻到50℃以下，用1×PBST洗掉其表面的修復(fù)液。3%H2O2室溫孵育10min，PBS沖洗，2min×3次。10%牛血清的封閉液封閉，室溫孵育1 h。傾去血清，滴加1∶200的稀釋抗體，4℃過夜。PBS沖洗，2 min×3次。1∶1 000稀釋二抗，37℃孵育30 min。PBS沖洗，2 min×3次。二氨基聯(lián)苯胺法（DAB）顯色。蒸餾水沖洗，復(fù)染，脫水透明，中性樹膠封片，晾干后用顯微鏡觀察，照相。

3.3 統(tǒng)計分析 采用Image-Pro Plus6．0軟件對圖像進行分析，計算平均陽性光密度。采用SPSS 22．0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理。計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）進行描述，多組比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較用SNK-q檢驗；設(shè)置雙側(cè)檢驗水準 α=0．05，P＜0．05 為差異有統(tǒng)計學意義。

4 實驗結(jié)果

4.1 對大鼠自發(fā)性發(fā)作（SRS）的影響 采用氯化鋰-匹羅卡品癲癇動物模型，造模成功率為93%。在造模及隨后為期60 d的灌胃過程中，發(fā)現(xiàn)致癇大鼠均出現(xiàn)了癲癇慢性期的行為學改變，即SE后15 d到兩個月內(nèi)出現(xiàn)反復(fù)SRS，最初多為局部性發(fā)作如前肢陣攣或面部抽搐，很快發(fā)展至全身強直性驚厥發(fā)作，持續(xù)時間一般不超過1 min，SRS均可自行終止。

空白組未見抽搐發(fā)作，其余各組均有SRS發(fā)作，與模型組比較，各熄風膠囊治療組SRS發(fā)作次數(shù)均低于模型組（P＜0．05），且有隨劑量增大效果越好趨勢，但組間比較沒有統(tǒng)計學意義。見表1。

表1 熄風膠囊對致癇大鼠SRS的影響（±s）Tab.1 EffectsofXifengCapsuleonSRSinepilepticrats(±s)

表1 熄風膠囊對致癇大鼠SRS的影響（±s）Tab.1 EffectsofXifengCapsuleonSRSinepilepticrats(±s)

注：與空白組比較，*P＜0．05；與模型組比較，#P＜0．05。

組別 動物數(shù) SRS發(fā)作次數(shù)（次）空白組 6 0模型組 6 29．60±2．69*熄高組 6 15．73±1．58*#熄中組 6 17．07±2．40*#熄低組 6 18．60±2．16*#

4.2 免疫組化實驗結(jié)果 光鏡（×200）下觀察，發(fā)現(xiàn)Nav1．1的免疫反應(yīng)物呈現(xiàn)棕褐色顆粒狀或者點狀免疫標記。所有大鼠海馬CA1、CA3及齒狀回區(qū)分子層及顆粒層均可見深染的顆粒狀免疫反應(yīng)物，呈點片狀分布。致癇大鼠的神經(jīng)元和Nav1．1的表達變化主要發(fā)生在CA3區(qū)，CA1區(qū)和DG區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)受累較少。

海馬CA3區(qū)免疫組化結(jié)果見圖1。空白組：顯示神經(jīng)元分布均勻且較密集，核呈圓形，可見小核仁。Nav1．1免疫反應(yīng)物廣泛分布于細胞的胞核和胞漿。模型組可見棕褐色區(qū)域減少，且變淡，說明多灶狀神經(jīng)元明顯減少，且分布不均勻，以CA3區(qū)為重，證實該區(qū)域神經(jīng)元退變、壞死，Nav1．1在神經(jīng)元退變、壞死部位染色變淺，甚至消失；在變性、壞死的神經(jīng)元周圍的正常組織中染色增強。熄低組可見棕褐色區(qū)域明顯減少、變淡，證實大量神經(jīng)元退變、消失，殘存神經(jīng)元呈退行性改變；熄中組可見棕褐色區(qū)域部分減少、輕度變淡，證實神經(jīng)元部分退變、消失，數(shù)量不多；熄高組棕褐色區(qū)域稍變少，未見明顯變淡，證實少量神經(jīng)元退變、消失。中藥各治療組在變性、壞死的神經(jīng)元周圍的正常組織中染色增強不明顯。

對于Nav1．1的表達情況，見表2。CA1區(qū)與DG區(qū)Nav1．1蛋白的表達變化不明顯。CA3區(qū)，與空白組比較，模型組的Nav1．1蛋白的表達水平上調(diào)（P＜0．05）；與模型組比較，各治療組的 Nav1．1 蛋白的表達水平均下調(diào)（P＜0．05），各組相比較，隨熄風膠囊劑量升高有減少趨勢，但差異沒有統(tǒng)計學意義（P＞0．05）。

5 討論

圖1 Ⅰ型鈉通道α亞基（Nav1.1）蛋白在海馬各個區(qū)域的表達情況（×200）Fig.1 Expression of voltage-gated type I sodium channel α subunit protein(Nav1.1)in hippocampus of epileptic rats（×200）

表2 熄風膠囊對氯化鋰-匹羅卡品致癇大鼠海馬Ⅰ型鈉通道α亞基蛋白表達的影響（x±s）Tab.2 Effect of Xifeng Capsule on the expression of voltage-gated type I sodium channel α subunit protein in hippocampus of epileptic rats induced by lithium chloride and pilocarpine(±s)

表2 熄風膠囊對氯化鋰-匹羅卡品致癇大鼠海馬Ⅰ型鈉通道α亞基蛋白表達的影響（x±s）Tab.2 Effect of Xifeng Capsule on the expression of voltage-gated type I sodium channel α subunit protein in hippocampus of epileptic rats induced by lithium chloride and pilocarpine(±s)

注：與空白組比較，*P＜0．05；與模型組比較，#P＜0．05。

組別空白組模型組熄高組熄中組熄低組動物數(shù)6 6 6 6 6 CA1區(qū) CA3區(qū) DG區(qū)0．210±0．000 0．210±0．000 0．210±0．000 0．202±0．008 0．235±0．008* 0．213±0．003 0．211±0．002 0．207±0．005# 0．208±0．014 0．210±0．001 0．210±0．002# 0．212±0．002 0．202±0．008 0．213±0．002# 0．197±0．013

哺乳動物鈉離子通道是由1個α大亞基（260KD）和2個輔助β亞基（32-37KD）構(gòu)成的復(fù)合體，其中α亞基是鈉通道的功能性亞單位，分為9個亞型，即 Nav1．1-Nav1．9，其中 Nav1．1、Nav1．2、Nav1．3和Nav1．6表達于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。編碼Na1．1的基因SCN1A與癲癇的關(guān)系密切[2]。電壓門控性鈉通道是細胞動作電位產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，其開放引起的去極化內(nèi)向電流是興奮性細胞產(chǎn)生動作電位的關(guān)鍵[3]，結(jié)構(gòu)和功能異常引起的活性改變是癲癇的病理基礎(chǔ)[4]，因此調(diào)節(jié)鈉通道功能成為許多抗癲癇藥物的作用機制。

馬融教授提出癲癇病機為腎精虧虛，痰瘀阻絡(luò)，治宜益腎填精、豁痰熄風，因此研制了熄風膠囊。前期研究證實熄風膠囊能夠降低致癇大鼠的SRS，有效抑制多藥耐藥相關(guān)蛋白1（MRP1）的過度表達[5]，干預(yù)海馬顆粒細胞層及內(nèi)分子層P38和GAP的表達，從而起到減輕海馬損傷的作用[6]。

Nav1．1在海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)和DG區(qū)廣泛分布，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)致癇大鼠海馬CA1區(qū)和DG區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)基本正常，且Nav1．1變化不明顯，在CA3區(qū)，模型組致癇大鼠神經(jīng)元變性、壞死明顯，Nav1．1在神經(jīng)元變性、壞死部位染色變淺，甚至消失，在變性、壞死神經(jīng)元周圍的正常組織中染色增強的表達特點，證實致癇大鼠神經(jīng)元變性壞死，Nav1．1隨之丟失，導(dǎo)致周圍正常錐體神經(jīng)元上的Nav1．1反應(yīng)性增加，從而表現(xiàn)為Nav1．1的上調(diào)，這種表達的上調(diào)可能直接參與了癲癇樣放電的發(fā)生[7-8]。

神經(jīng)元和Nav1．1的表達變化主要發(fā)生在CA3區(qū)，CA1區(qū)和DG區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)受累較少，說明CA3區(qū)為主要損傷部位，這與前期研究一致[6]。其中，模型組可見CA3區(qū)神經(jīng)元退變、壞死，Nav1．1在神經(jīng)元退變、壞死部位染色變淺，甚至消失；而在熄風膠囊治療組中，隨劑量增大，退變、消失的神經(jīng)元減少，提示熄風膠囊對致癇大鼠海馬具有神經(jīng)保護作用，且與劑量成正相關(guān)，這與前期研究一致[6]，同時棕褐色區(qū)域減少程度減低，提示熄風膠囊可以減少Nav1．1蛋白的丟失，這種表現(xiàn)與劑量成正相關(guān)。模型組中在變性、壞死的神經(jīng)元周圍的正常組織中染色增強，而在中藥各治療組在變性、壞死的神經(jīng)元周圍的正常組織中染色增強不明顯，而且從定量分析來看，模型組Nav1．1的表達量增多，而各熄風膠囊治療組去增加不明顯，提示熄風膠囊可以減少神經(jīng)元壞死區(qū)域周圍正常組織Nav1．1的表達上調(diào)。

本實驗結(jié)果表明熄風膠囊對致癇大鼠海馬Nav1．1蛋白的表達有減少神經(jīng)元壞死區(qū)丟失和周圍正常組織上調(diào)的作用，結(jié)合光電鏡結(jié)果提示各治療組大鼠海馬神經(jīng)元的丟失情況均有不同程度的改善，因此本實驗證實熄風膠囊可能通過保護海馬神經(jīng)元，調(diào)節(jié)IE大鼠海馬神經(jīng)元Nav1．1的表達，推測其可通過對鈉通道的抑制作用以降低神經(jīng)元細胞膜興奮性而發(fā)揮抗癲癇作用。