響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取明月草中總黃酮工藝研究

尹偉

(安徽新華學(xué)院藥學(xué)院，安徽 合肥 230088)

林騰

(安徽省銅陵市義安區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局，安徽 銅陵 244105)

張國升

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230031)

明月草(AngelicaKeiskei)為多年生常綠植物，高30～80cm，葉子為卵圓形，生命力極強(qiáng)。明月草內(nèi)黃酮類成分含量豐富，包括特有成分查爾酮等，被譽(yù)為21世紀(jì)人類的健康食品。現(xiàn)代研究顯示，植物黃酮類化合物對(duì)生物體內(nèi)的自由基有很好的清除作用，同時(shí)具有抗氧化等作用[1]，能夠有效地降低動(dòng)物體內(nèi)的總膽固醇以及甘油三脂的含量，也有很好的抗病毒等作用[2,3]。明月草中黃酮類成分具有降血糖等生物活性，目前已作為有生物活性的天然產(chǎn)物，成為研究熱點(diǎn)[4～9]。

目前，關(guān)于明月草總黃酮的提取方法研究較少，未見關(guān)于明月草總黃酮提取工藝上各影響因素之間的交互作用報(bào)道。傳統(tǒng)的正交試驗(yàn)對(duì)各項(xiàng)試驗(yàn)因素的考察，由于試驗(yàn)誤差較大，已經(jīng)不能很好的滿足相關(guān)試驗(yàn)要求。超聲輔助提取方法，是利用超聲波的粉碎技術(shù)，使得植物的成分能夠更好地溶出，比傳統(tǒng)提取方法收率高[10]。為此，筆者在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)明月草總黃酮的提取工藝進(jìn)行研究。該研究采取響應(yīng)面法，優(yōu)化總黃酮提取工藝，觀察超聲提取功率、液料比、超聲功率以及超聲時(shí)間等因素對(duì)明月草總黃酮提取收率的影響，旨在為明月草總黃酮的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

明月草采自安徽合肥。

無水乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究院)。所有試劑均為分析純。

紫外分光光度計(jì)(UV-9000，上海奧西科學(xué)儀器有限公司)；電子天平(Sartorius BT)；離心機(jī)(GT10-1，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將新鮮的明月草洗凈、晾干、粉碎，放置干燥器中備用。精確稱取蘆丁(干燥至恒重)的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品1.0mg，用乙醇定溶至100mL，得0.1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。精確吸取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL的標(biāo)準(zhǔn)液，分別置于10mL比色管中，分別加入30%的乙醇5mL，5%亞硝酸鈉0.3mL，搖勻，靜置10min，加入10%硝酸鋁0.3mL，搖勻，靜置10min，加1mol/L氫氧化鈉溶液4mL，加去離子水定容，搖勻，靜置10min。用空白試劑作為參比液調(diào)零，測(cè)定吸光度(510nm)。以吸光度A作為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度Y作為橫坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y= 0.0886A-0.0007，R2= 0.9997，線性關(guān)系良好。

1.2.2明月草總黃酮的提取

精確稱取10g明月草粉末，置于250mL的燒杯中，加入100mL 70%(體積分?jǐn)?shù))的乙醇溶液，在功率為200W的超聲清洗器中提取5h，提取完成后，離心(5000 r/min)0.5h，去上清液于250mL定容。

1.2.3明月草總黃酮的測(cè)定

采用硝酸鋁-亞硝酸鈉法測(cè)定，取1mL提取液按照測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測(cè)定吸光度A，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線算出樣品的質(zhì)量濃度Y，同時(shí)計(jì)算得出總黃酮的收率：

式中，Y為樣品中總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；m為明月草粉末的質(zhì)量，g；V1為比色管中溶液體積，mL；V2為待測(cè)樣分取的體積，mL；V3為待測(cè)樣的總體積，mL。

1.2.4單因素試驗(yàn)

1)提取溶劑乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)明月草總黃酮收率的影響 設(shè)定超聲時(shí)間為2h、液料比為50∶1、超聲功率為200W，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、70%、80%、90%時(shí)對(duì)明月草總黃酮收率的影響。

2)液料比對(duì)明月草總黃酮收率的影響 采用優(yōu)化后的乙醇體積分?jǐn)?shù)，選擇超聲時(shí)間為2h，超聲功率為200W，考察液料比分別為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1(mL/g)時(shí)對(duì)明月草總黃酮收率的影響。

3)超聲時(shí)間對(duì)明月草總黃酮收率的影響 采用優(yōu)化后的乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比，選取超聲功率為200W，考察超聲時(shí)間分別為0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4h時(shí)對(duì)明月草總黃酮收率的影響。

4)超聲功率對(duì)明月草總黃酮收率的影響 采用優(yōu)化后的液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間，考察超聲功率分別為100、150、200、250、300、350、400、450W時(shí)對(duì)明月草總黃酮收率的影響。

5)提取溫度對(duì)明月草總黃酮收率的影響 采用優(yōu)化后的液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間、超聲功率，考察提取溫度分別為40、50、60、70、80、90℃時(shí)對(duì)明月草總黃酮收率的影響。

1.2.5Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

綜合單因素試驗(yàn)后，選擇超聲時(shí)間等作為自變量，明月草總黃酮的收率作為因變量(響應(yīng)值)，使用Box-Benhnken方法[11]優(yōu)化明月草總黃酮的提取工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

單因素試驗(yàn)結(jié)果見圖1。

2.1.1乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)明月草總黃酮收率的影響

由圖1(a)可知，提取溶劑乙醇體積分?jǐn)?shù)小于70%時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的不斷增加，總黃酮的收率亦是不斷升高。但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于70%時(shí)，總黃酮的收率逐漸下降。這可能是因?yàn)槊髟虏葜悬S酮極性范圍較大，70%的乙醇的極性與明月草黃酮中的黃酮化合物極性相似，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的上升，導(dǎo)致明月草中糖類等化合物析出，最終導(dǎo)致黃酮類化合物溶出的降低[12]。

2.1.2液料比對(duì)明月草總黃酮收率的影響

由圖1(b)可知，隨著液料比的不斷增大，總黃酮的相應(yīng)收率也在不斷增加，同時(shí)在40∶1～60∶1時(shí)趨于平衡，在50∶1時(shí)的總黃酮的收率最大，但在大于60∶1時(shí)，總黃酮的收率不斷下降，可能是因?yàn)樵谝毫媳?0∶1時(shí)，溶劑已經(jīng)能夠充分包裹物料，即使此時(shí)增加相應(yīng)的溶劑比例，也不能有效地提高總黃酮的收率。

2.1.3超聲時(shí)間對(duì)明月草總黃酮收率的影響

在智能化潮流的席卷下，不管是傳統(tǒng)的設(shè)備制造企業(yè)、系統(tǒng)集成商，還是近年來新興的智能物流解決方案提供者，都面臨著機(jī)遇和挑戰(zhàn)。作為智能化物流設(shè)備領(lǐng)域一支不可忽視的力量，我們來聽一聽上海音鋒機(jī)器人股份有限公司副總經(jīng)理吳偉剛先生對(duì)行業(yè)有何看法

由圖1(c)可知，在超聲時(shí)間為3h時(shí)，明月草總黃酮的收率最高，隨著時(shí)間的延長，收率緩慢下降。可能是因?yàn)樵?h時(shí)，明月草的黃酮類化合物已經(jīng)完全溶出，3h后有部分黃酮類化合物被超聲波破壞分解，導(dǎo)致明月草總黃酮收率降低。

2.1.4超聲功率對(duì)明月草總黃酮收率的影響

由圖1(d)可知，在超聲功率小于350W時(shí)，隨著超聲功率的增大，明月草總黃酮的收率是不斷升高的，但大于350W時(shí)，收率出現(xiàn)了下降。可能是由于明月草中能使得黃酮類物質(zhì)降解的酶等物質(zhì)被不斷釋放出來，影響總黃酮收率[13]。

2.1.5提取溫度對(duì)明月草總黃酮收率的影響

由圖1(e)可知，隨著明月草總黃酮提取溫度的不斷升高，在溫度約為80℃時(shí)，總黃酮的收率最大，但在溫度升高至80℃后，溫度對(duì)總黃酮的收率影響較小，且趨于穩(wěn)定。因此，選取溫度80℃作為提取明月草總黃酮的條件，但不作為響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的相關(guān)指標(biāo)。

圖1 明月草總黃酮提取中各種單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

Box-Benhnken 試驗(yàn)因子及編碼值詳見表1，試驗(yàn)審計(jì)編排組合見表2。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

Y= 12.89+0.071A-0.25B+0.31C+0.28D-0.0065AB-0.18AC+0.14AD+0.061BC+0.38BD+0.24CD-0.33A2-0.40B2-0.27C2-0.52D2

由表3方差分析與顯著性檢驗(yàn)可得出，回歸方程模型極顯著(P<0.01)，方程失擬項(xiàng)不顯著(P= 0.7103)，表明該回歸模型與實(shí)測(cè)值能較好的擬合。回歸系數(shù)R2=0.9997>0.9，表明該模式相關(guān)度較好。在一次項(xiàng)的F檢驗(yàn)可以得到，各考察因素對(duì)明月草總黃酮收率的影響因素為：C>D>B>A，已經(jīng)達(dá)到極顯著水平[14]。

表1 明月草總黃酮提取試驗(yàn)因素水平編碼表

表2 明月草總黃酮提取試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 方差分析

2.4 響應(yīng)面分析圖

響應(yīng)面圖形是由相應(yīng)的響應(yīng)值與對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)因素(A、B、C、D)之間所形成的曲面圖形以及等高線圖形，如圖2所示，能夠直觀地對(duì)各因素及其各因素之間的交互作用進(jìn)行有效反映。

圖2 各單因素之間相互影響及等高線分析圖

響應(yīng)面的坡度越陡峭，表示相應(yīng)的響應(yīng)值對(duì)相關(guān)條件越為敏感，對(duì)黃酮收率的影響就越大，反之則顯示因素對(duì)黃酮的影響就越小，同時(shí)由等高線可以得到其極值的相關(guān)條件在圓心[9]。

由圖2可知，4個(gè)因素下各響應(yīng)面的坡度都比較陡峭，說明液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間、超聲功率對(duì)明月草總黃酮的提取收率影響都非常顯著。由圖2(a)可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)與液料比對(duì)總黃酮收率影響較為顯著，等高線為橢圓形，兩者之間的交互作用顯著。由圖2(b)可以看出，超聲時(shí)間與液料比兩因素中，當(dāng)超聲時(shí)間約在3h時(shí)，明月草總黃酮收率最高。由圖2(c)得出，超聲功率在一定范圍內(nèi)能有效增加明月草總黃酮的收率，但在大于350W時(shí)，表現(xiàn)出下降趨勢(shì)。由圖2(d)、2(e)、2(f)可以看出,超聲時(shí)間與乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率與乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率與超聲時(shí)間都表現(xiàn)非常好的交互作用，對(duì)明月草總黃酮的影響較大。

2.5 優(yōu)化提取參數(shù)和驗(yàn)證模型

經(jīng)響應(yīng)面法數(shù)據(jù)分析，最終確定明月草總黃酮的最佳提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，液料比50∶1，超聲時(shí)間3h，超聲功率350W，提取溫度80℃，明月草總黃酮收率的最大預(yù)測(cè)值為7.23%。按上述相關(guān)提取條件，進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，收率為6.89%，誤差較小。

3 結(jié)語

1)通過Box-Behnken組合設(shè)計(jì)以及響應(yīng)面分析，建立了明月草總黃酮的數(shù)學(xué)模型，探討了超聲時(shí)間、液料比、超聲功率以及乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)明月草總黃酮收率的影響。

2)經(jīng)響應(yīng)面法數(shù)據(jù)分析，最終確定明月草總黃酮的最佳提取條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，液料比50∶1，超聲時(shí)間3h，超聲功率為350W，提取溫度為80℃。據(jù)該條件，驗(yàn)證性試驗(yàn)得其收率為6.89%，與預(yù)測(cè)值相符性較好。

3)試驗(yàn)所得到的明月草總黃酮的提取工藝有較好的應(yīng)用性，能為明月草總黃酮的提取工藝優(yōu)化提供參考，為明月草植物資源的綜合利用提供依據(jù)。