水稻矮縮病毒Pns6和P8蛋白在病毒侵染水稻原生質體后的表達

張潔 宛柏杰 2, 尚鵬祥 丁新倫 杜振國 吳祖建*

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水稻矮縮病毒Pns6和P8蛋白在病毒侵染水稻原生質體后的表達

張潔1,＃宛柏杰1, 2,＃尚鵬祥1丁新倫1杜振國1吳祖建1,*

(1福建農林大學 植物病毒研究所/福建省植物病毒學重點實驗室/閩臺作物有害生物生態防控國家重點實驗室, 福州 350002;2江蘇沿海地區農業科學研究所, 江蘇 鹽城 224000;＃共同第一作者;*通訊聯系人, E-mail: wuzujian@126.com)

【目的】為明確水稻矮縮病毒, RDV) Pns6和P8蛋白在病毒侵染水稻原生質體后的表達動態，【方法】利用PEG介導的病毒侵染原生質體體系，通過免疫熒光和電鏡技術分析Pns6、P8蛋白以及病毒粒體在水稻原生質體中的定位；同時，通過Western blot和實時熒光定量PCR分析Pns6和P8蛋白及其RNA在水稻原生質體中的積累量?！窘Y果】病毒接種水稻原生質體48 h后，Pns6蛋白在細胞質中可以形成類似于病毒原質(viroplasm)的點狀內含體，P8蛋白也大量的表達。同時，病毒粒體在水稻原生質體中也形成內含體狀的結構。病毒接種水稻原生質體12 h后，均可檢測到Pns6和P8蛋白的表達，并且在36 h后達到最高值。病毒接種水稻原生質體后，RNA在24 h時表達量達到最高，RNA在36 h時表達量達到最高?！窘Y論】RDV侵染水稻原生質體后，Pns6和P8蛋白均有表達，并且病毒也可能通過形成病毒原質來完成病毒在寄主細胞的復制和裝配。

水稻矮縮病毒；水稻原生質體；Pns6蛋白；P8蛋白

水稻矮縮病毒(, RDV)屬于呼腸孤病毒科()植物呼腸孤病毒屬()。該病毒是水稻矮縮病的病原，廣泛分布于朝鮮、日本、菲律賓等水稻種植區，在我國主要分布于福建、云南和海南等南方稻區。該病毒可以通過黑尾葉蟬()和電光葉蟬()等傳播，并且可以通過卵將病毒傳播給子代[1]。水稻矮縮病在水稻生長發育整個時期都可以發病，大暴發年份可造成水稻嚴重減產、甚至絕收[2, 3]。

RDV全基因組由12條雙鏈RNA(S1~S12)組成，編碼的蛋白可以分為兩類，其中包括7個結構蛋白(P)和5個非結構蛋白(Pns)。其中，P1具有依賴于RNA的RNA聚合酶的特殊結構序列模式[4]。P2位于病毒粒子的最外層，在病毒侵染寄主細胞或者介體昆蟲傳播病毒過程中起重要作用[5, 6]。此外，P2能與水稻貝殼杉烯氧化酶互作，影響赤霉素合成，從而引起水稻矮縮癥狀[7]，并可通過與水稻吲哚乙酸(OsIAA10)的互作來增強病毒的侵染和癥狀的形成[8]。P3形成的核衣殼蛋白包裹著S1編碼的RdRp、S5編碼的鳥苷轉移酶、S7編碼的RNA結合蛋白以及基因組RNA[4, 9]。Pns4是一種磷酸化蛋白，在病毒的組裝和運輸以及侵染和復制過程中起重要作用[10, 11]。P5為次要核心蛋白，可能具有鳥苷酸轉移酶和核苷酸轉移酶活性[12]。Pns6為病毒的運動蛋白，且具有ATPase和RNA結合活性[13, 14]。此外，Pns6通過與Pns11互作，而Pns11與Pns12互作，參與形成病毒裝配和復制的病毒原質[15, 16]。P7為小核心蛋白，能夠結合核酸，并對mRNA有較高的親和力，能與P1和P5形成蛋白復合體，在病毒裝配過程中具有關鍵作用[17, 18]。P8是病毒最主要的外殼蛋白[19]，定位于過氧化酶體并與乙醇酸氧化酶(GOX)互作，推測其參與病毒的復制[20]。P9與P8、P2共同組成病毒外層殼蛋白，可能通過其轉錄激活活性參與調控相關基因的表達[21, 22]。Pns10能抑制dsRNA誘導的RNA沉默，為沉默抑制子蛋白，在抑制寄主水稻防御病毒侵染中起作用[23]。此外，Pns10在昆蟲細胞中形成小管結構，并能將小管延伸至相鄰的細胞，從而使病毒在寄主體內快速侵染[24, 25]。Pns11能夠與核酸進行非特異性結合，主要是由于其具有N-端鋅指結構[26]。此外，Pns11還可以與核仁編碼的Fibrillarin蛋白互作，并且可以定位在細胞核和葉綠體中，這揭示了RDV侵染寄主后，可能通過Pns11蛋白與核仁蛋白互作來誘發病害[27]，Pns11還可以特異地與水稻S-腺苷甲硫氨酸合成酶(OsSAMS1)互作，誘導產生大量乙烯，促進病毒侵染[28]。Pns12是病毒原質狀內含體的主要組成部分，是病毒復制和侵染的主要調控蛋白[15, 16]。

近年，利用介體昆蟲培養細胞體系來研究RDV各蛋白的功能等方面取得了較大進展[10, 15, 16, 24, 25]。本研究借鑒介體昆蟲培養細胞體系，利用水稻原生質體體系，通過PEG介導的方法解決病毒不能夠同步侵染植物寄主的問題，再結合實時熒光定量PCR技術、免疫熒光技術、電鏡技術以及Western blot技術等來研究病毒蛋白在原生質體內的表達情況，為進一步研究RDV各基因在植物寄主細胞中的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

感染水稻矮縮病毒(, RDV)的水稻采自福州市郊區，經RT-PCR鑒定后，在防蟲溫室中種植保存。Pns6和P8蛋白抗體由本實驗室制備保存。

1.2 RDV的提取及侵染

病毒提取方法參考文獻[29]進行。稱取1 g感染RDV的水稻毒株葉片，70%酒精消毒10 min，無菌水清洗3遍后晾干；將樣品剪碎后放入無菌的研缽中，加入石英砂和2.5 mL MMg溶液(0.4 mol/L甘露醇、15 mmol/L MgCl2、4 mmol/L MES, pH 5.7)進行研磨；將充分研磨的樣品轉移到無菌的離心管中，4℃、7000 r/min條件下離心10 min，去掉石英砂以及殘渣，取上清液，4℃、12 000 r/min下離心10 min，再吸取上清，重復離心1次；最后將得到的上清液過濾除菌，即為病毒的粗提液。

參考文獻[30]的方法，利用聚乙二醇(PEG)介導病毒侵染原生質體。

1.3 酶解法制備水稻原生質體

用參考文獻[30]的方法進行水稻原生質體的制備。取60株培養12~15 d的水稻幼苗，用無菌剪刀剪掉水稻葉片部分保留莖稈；將所取材料切成0.5 mm的細條，放入滅菌的50 mL三角瓶中，加入30 mL 0.6 mol/L甘露醇，28℃、50 r/min黑暗條件下搖動15 min；倒掉甘露醇溶液，將材料置于另一只干凈滅菌三角瓶中，并加入20 mL酶液(1.5% 纖維素酶R-10，0.75% 離析酶R-10，0.6 mol/L甘露醇，10 mmol/L MES，10 mmol/L CaCl2，0.1% BSA，pH 5.7)，于28℃ 60~80 r/min酶解4~5 h；酶解完畢后加入等體積預冷的W5溶液(154 mmol/L NaCl，125 mmol/L CaCl2，5 mmol/L KCl，2 mmol/L MES，pH 5.7)，劇烈震蕩15 s后，尼龍網膜過濾；用W5溶液清洗原生質體，1000 r/min下離心5 min后棄上清，重復3~5次后加入MMg溶液，收集原生質體后鏡檢，在冰上靜置40 min備用。

采用參考文獻[31]的方法用二乙酸熒光素(FDA)檢測水稻原生質體活性。

1.4 免疫熒光標記檢測目的蛋白的表達

參考文獻[32]的方法進行蛋白的免疫熒光標記。將培養48 h的原生質體4℃、1000 r/min條件下離心5 min后，棄上清；向裝有原生質體的離心管中加入4%多聚甲醛固定液，并在室溫黑暗條件下放置90 min；4℃、1000 r/min下離心5 min，W5溶液清洗3次，去除固定液；將樣品滴加到經過多聚賴氨酸處理過的粘附載玻片上，用吸水紙吸走多余的水；待樣品緊貼在載玻片上時，加入適量的5% BSA封閉液封閉45 min；PBS (pH 7.2)洗滌玻片3次，每次5 min；加入1~5 μg/mL標記異硫氰酸熒光素(FITC)的熒光抗體(熒光抗體標記方法參照文獻[33]進行)，室溫避光孵育1 h；用PBS洗滌玻片3次，每次5 min；Leica熒光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.5 Western blot檢測目的蛋白的表達動態

取等量RDV侵染不同時間段(0 h，12 h，24 h，36 h，48 h，60 h)的水稻原生質體，提取其蛋白后，進行12.5% SDS-PAGE檢測，電泳完畢，通過電轉法(電壓60 V，時間35 min左右)轉印到PVDF膜上。Western blot檢測方法參照文獻[30]進行。通過Image J軟件計算條帶灰度值，將各時間點目的蛋白與相應時間GAPDH內參蛋白對照樣品值進行比較。實驗重復3次。

1.6 實時熒光定量PCR檢測目的基因的表達動態

利用絕對定量來測定水稻原生質體中Pns6和P8的表達量。將含有RDV目的片段基因(Pns6和P8)的質粒作為標準品，系列梯度稀釋至含有103~106個拷貝的模板，以稀釋后的標準品作為模板進行實時熒光定量PCR，以標準品濃度的稀釋倍數為橫坐標，以Ct循環數為縱坐標分別建立目的基因的標準曲線。

使用康為RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒提取侵染不同時間(12 h，24 h，36 h，48 h，60 h)的水稻原生質體RNA。使用天根FastQuant cDNA第1鏈合成試劑盒進行反轉錄，將配置好的反轉錄混合液(10×快速RT緩沖液2 μL，RT酶混合液1 μL，FQ-RT 引物混合液2 μL，補足無RNA酶的ddH2O至20 μL)加至去除總DNA的10 μL RNA中，42℃下，孵育15 min；95℃下孵育2 min后放冰上2 min，將cDNA置于?20℃下保存備用。以cDNA為模板，引物對S6-F：5′-TTTCGGGATAATGCTGCTGAC-3′ / S6-R：5′-CCGCCAAATAAGCAAACCA-3′和S8-F：5′-TAC AGCCATCAGCTAAGCCAAA-3′ / S8-R：5′-CCGCA ACAGACCGAAACA-3′分別進行熒光定量PCR，將得到的值分別代入目的基因的標準曲線，計算出樣本的拷貝數，每次實驗重復3次。

1.7 電鏡觀察病毒在水稻原生質體中的定位

采用參考文獻[34]的方法進行常規電鏡切片操作，將RDV侵染24 h后的水稻原生質體進行透射電鏡觀察。

2 結果與分析

2.1 水稻矮縮病毒(RDV)侵染水稻原生質體

將RDV病毒粒子粗提后進行負染，電鏡觀察發現病毒粒子形態完整。酶解法獲得水稻原生質體，經由FDA來檢測原生質體的活性，活性比例在95%以上，且原生質體的完整性好。利用PEG介導的病毒侵染原生質體方法，對制備的水稻原生質體進行侵染，48 h后，分別利用RDV Pns6和P8蛋白抗體進行免疫熒光顯微鏡觀察。對照組中沒有檢測到熒光信號(圖1-A)，實驗組中Pns6蛋白在細胞質中形成類似于病毒原質狀內含體(圖1-B)。外殼蛋白P8在細胞質中也大量表達，呈分散狀排列，部分形成顆粒狀結構(圖1-C)，說明病毒已經在原生質體中進行了大量復制及裝配。

為進一步明確RDV在水稻原生質體中的復制情況，將病毒侵染24 h的水稻原生質體，進行常規電鏡切片觀察，結果顯示，水稻原生質體中可以觀察到類似病毒原質的內含體狀結構，內有較多病毒粒體存在(圖1-D)。

A?陰性對照；B?激光共聚焦顯微鏡觀察Pns6蛋白在水稻原生質體中的定位；C?激光共聚焦顯微鏡觀察P8蛋白的定位；D?透射電鏡觀察水稻矮縮病毒的定位，箭頭示病毒粒體。

Fig. 1. Subcellular localization ofin rice protoplasts under an electron microscope.

2.2 RDV侵染水稻原生質體后Pns6和P8蛋白的表達動態

為明確RDV侵染水稻原生質體后Pns6和P8蛋白的表達情況，對病毒侵染不同時間后的原生質體提取蛋白，分別利用Pns6、P8以及GAPDH蛋白抗體進行Western blot檢測。結果顯示，病毒侵染原生質體12 h后均可檢測到Pns6和P8蛋白的表達(圖2-A)。36 h左右兩者表達量均達到最高，隨后有遞減的趨勢，但仍保持較高的水平(圖2-B)?？傮w而言，P8蛋白表達量高于Pns6蛋白(圖2-B)。

A?蛋白的Western blot; B?相對蛋白表達量。

Fig. 2. Expression of Pns6 and P8 in rice protoplasts after virus inoculation by Western blot.

圖3 實時定量PCR檢測水稻矮縮病毒在侵染水稻原生質體后Pns6和P8 RNA的表達量

Fig. 3. Expression ofandRNA in rice protoplasts after virus inoculation by real-time quantitative RT-PCR.

2.3 RDV侵染水稻原生質體后Pns6和P8 RNA的表達動態

為明確RDV侵染水稻原生質體后和RNA的表達情況，以病毒侵染不同時間后的原生質體提取RNA，進行實時熒光定量PCR檢測。結果表明，RNA在24 h時表達量達到最高，36 h時下降為最高值的74.9%，60 h時下降為最高值的46.2%，檢測區間內均具有顯著性差異(<0.05)。RNA在36 h時表達量達到最高，48 h時下降為最高值的55.9%，60 h時下降為最高值的40.9%，但最后兩個檢測區間無顯著性差異(>0.05)。從整體趨勢看，兩者的表達量都是先上升后下降(圖3)。

3 討論

與水稻轉基因方法相比，利用水稻原生質體瞬時表達系統，在基因表達研究上具有快速簡便的特點。本研究利用原生質體體系對RDV在水稻原生質體內的復制和表達情況進行了分析，結果表明RDV侵染水稻原生質體后，在24~36 h達到復制高峰，理論上也是病毒與寄主互作最激烈的階段。這為利用水稻原生質體研究RDV與寄主互作的最佳時間提供了依據。從整體趨勢看，各基因的表達量都是先上升后下降。前期的上升符合病毒指數增長的特征，后期下降可能是因為病毒在原生質體內復制受到了限制，一方面由于寄主體內的資源有限，病毒不可能保持持續增殖；另一方面，寄主在受到病毒侵染后，細胞內的防御機制可能啟動，抑制病毒的增殖。熒光定量結果發現RNA先于RNA達到最高值，由此推測病毒優先進行非結構蛋白基因的復制然后再進行結構蛋白基因的復制。研究結果與水稻齒葉矮縮病毒(, RRSV)非結構蛋白Pns10和Pns7以及結構蛋白P8基因的表達保持一致[29, 30, 35]。蛋白定量結果顯示P8蛋白表達量要稍高于Pns6蛋白，可能與病毒裝配需要大量的結構蛋白有關。Wei等[16]利用昆蟲介體細胞培養體系對RDV所有結構蛋白和Pns12蛋白進行共定位，發現除了共定位的黃色熒光還存在大量的標示結構蛋白的綠色熒光，從另一個側面說明結構蛋白的表達量高于非結構蛋白的表達，我們的結果與之一致。

同時，Wei等[16]發現RDV所有結構蛋白在昆蟲介體細胞中均呈彌散狀排列，跟Pns12共定位發現，病毒核心蛋白P1、P3、P5和P7等主要定位在病毒原質內部，而外層衣殼蛋白P2、P8和P9等主要定位在病毒原質周邊。本研究發現，RDV Pns6呈點狀均勻定位在細胞質中，P8呈彌散狀定位在細胞質中，并部分聚集為顆粒狀結構，這與RDV侵染昆蟲培養細胞一致。昆蟲介體中，Pns12是形成病毒原質必不可少的，推測P3和Pns11與Pns12直接互作，Pns6通過與Pns11互作而同時被招募到病毒原質中[15, 16]。植物寄主中，RDV Pns6是一個病毒運動蛋白，并具有RNA結合活性，可能參與組織病毒mRNA到病毒原質中[13-16]。本研究結果表明，RDV病毒粒體在寄主原生質體細胞中可能也通過內含體狀結構進行復制和裝配。然而寄主水稻中，RDV組成病毒原質的主要組分及其功能行使跟昆蟲介體是否完全一致有待進一步研究。

謝辭：特別感謝福建農林大學植物病毒研究所的王海濤和楊文婷同學在電鏡技術上的指導！

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Expression of Pns6 and P8 Proteins ofAfter Virus Infecting Rice Protoplasts

ZHANG Jie1,＃, WAN Baijie1, 2,＃, SHANG Pengxiang1, DING Xinlun1, DU Zhenguo1, WU Zujian1,*

(Institute of Plant Virology,//,,;,,;＃;*,)

【Objective】In order to clarify expression dynamics of Pns6 and P8 proteins ofafter virus infecting rice protoplasts, 【Method】subcellular localization of Pns6 and P8 proteins as well as viral particles in rice protoplasts were conducted with a PEG mediated virus infecting protoplast system by immunofluorescence and electron microscope. Meanwhile, accumulation of Pns6 and P8 proteins and their RNAs in rice protoplasts were measured by Western blot and real-time fluorescence quantitative PCR. 【Result】Pns6 protein could form viroplasm-like punctate inclusion bodies in cytoplasm 48 h after virus inoculation, and P8 protein was also expressed in large quantities. Meanwhile, viral particles could forminclusion body-like structure in rice protoplasts. Expression of Pns6 and P8 proteins was both detected at 12 h after virus inoculation, and reached the maximum level after 36 h. At the same time, the expression level ofRNA peaked at 24 h and that ofRNA at 36 h after virus inoculation. 【Conclusion】Pns6 and P8 proteins were both expressed after virus infection, andmay also formed viroplasm-like inclusion bodies to complete virus replication and assembly in host cells.

; rice protoplast; Pns6 protein; P8 protein

10.16819/j.1001-7216.2019.8109

S435.111.4+9; S511.034

A

1001-7216(2019)02-0118-06

2018-09-29;

2018-11-12。

國家自然科學基金資助項目(31672005)；福建農林大學科技創新專項(CXZX2017324, CXZX2016132)。