狗棗獼猴桃胚胎發育晚期富集蛋白的生物信息學分析

劉 丹，畢德瀧，陳 鑫，王立鳳

（牡丹江師范學院，黑龍江牡丹江 157012）

狗棗獼猴桃（Actinidia kolomikta）別名狗棗子，是獼猴桃科（Actinidiacese）獼猴桃屬（Actinidia）多年生落葉藤本植物，是最為耐寒的獼猴桃種類之一。主要分布于我國東三省、四川、云南等高山地區，俄羅斯、日本及朝鮮半島也有分布。喜生于闊葉、針葉混交灌木林且通風良好、土質濕潤、腐殖質肥沃的自然環境中。其果實富含維生素C、有機酸、蛋白質、多種糖類及人體所需的多種微量元素和氨基酸。狗棗獼猴桃的抗逆性強，還具有藥物開發、食用保健等經濟效益。是東北地區蘊藏豐富的野生漿果資源，是珍貴的抗寒種質資源［1-2］。胚胎發育晚期富集蛋白（late embryogenesis abundant protein，LEA），分子量在10～30 ku之間，具有高親水性，屬于逆境脅迫響應蛋白［3-4］。1989年Dure等在棉花種子中首次發現LEA的存在，后在大豆、水稻、擬南芥、葡萄等植物中陸續發現［5］，LEA的結構和功能一直以來都吸引著眾多科學家的興趣和重視，廣泛存在于植物中。到目前為止已克隆獲得上百種LEA基因［6］，通過各種分子生物學手段，人們發現，植物營養組織遭受干旱、低溫、ABA處理及鹽脅迫等逆境脅迫后，會產生許多新的mRNA和蛋白質，該蛋白質中相當大一部分均與LEA蛋白有同源性［7］。眾多研究表明LEA基因的功能主要與抗逆性有關，植物營養組織遭受逆境脅迫后均能誘導LEA基因的表達［8］。許多LEA基因轉化試驗也表明，LEA可顯著提高植物的抗逆性。LEA蛋白富含賴氨酸、甘氨酸、組氨酸等極性氨基酸，缺乏色氨酸和半胱氨酸，無明顯的二級結構，以一種無序狀態存在于溶液中。目前，LEA基因的研究越來越廣泛，大多研究集中在植物抗逆性方面［9］。鑒于LEA蛋白在植物抗逆性方面的重要作用，本研究以狗棗獼猴桃轉錄組數據為參考，篩選到LEA蛋白的cDNA序列，利用生物信息學方法對棗獼猴桃胚胎發育晚期富集蛋白的理化性質、疏水性/親水性、蛋白結構功能域、二級結構、三級結構及同源性等方面進行預測和分析，以期為狗棗獼猴桃抗寒能力形成的相關研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料來源

狗棗獼猴桃胚胎發育晚期富集蛋白cDNA序列從筆者所在實驗室轉錄組數據中獲得；山黃麻（Parasponia andersonii）、東方苔草（Trema orientale）、歐洲栓皮櫟（Quercus suber）、荷花（Nelumbo nucifera）、中華獼猴桃原變種（Actinidia chinensis var.chinensis）、蘋果（Malus domestica）、土瓶草（Cephalotus follicularis）、博落回（Macleaya cordata）、可可樹（Theobroma cacao）、甜椒（Capsicum annuum）、巴 卡廷辣椒（Capsicum baccatum）、番茄（Solanum lycopersicum）、向日葵（Helianthus annuus）、香 青 蒿（Artemisia annua）、楊 樹（Populus trichocarpa）、石榴（Punica granatum）等植物氨基酸序列在NCBI數據庫中下載。

1.2 方法

狗棗獼猴桃AkLEA的理化性質用Prot Param（https：//web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam）進行分析；NCBI-CDD進行保守結構域及蛋白家族預測（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/）；Inter-Prot Scan（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search）預測功能位點；NetNGlyc（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）對N-糖基化位點進行預測；NetOGlyc（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/）對O-糖基化位點進行預測；采用Predict Protein數據庫（https：//www.predictprotein.org/）對AkLEA蛋白進行二級結構預測；使用SWISS-MODEL（http：//swissmodel.Expasy.org/）在線軟件預測蛋白質三級結構。從NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫中獲得19條不同植物的LEA氨基酸序列信息，利用MEGA 5.0軟件的Neighbor-joining法構建蛋白質系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 LEA理化性質預測

利用Prot Param軟件對狗棗獼猴桃AkLEA氨基酸序列進行分析，結果表明，狗棗獼猴桃AkLEA基因cDNA全長為1 292 bp，編碼區（CDS）為cDNA上第247～912個堿基，共編碼221個氨基酸，分子量24 130.33 u，理論等電點為10.40，負電荷殘基總數（Asp+Glu）為49，正電荷殘基總數（Arg+Lys）為12，分子式為C1052H1770N314O306S13，總原子數3 455，親水性（GRAVY）的平均水平：0.152。不穩定指數（instability index，Ⅱ）為33.97，說明該蛋白較為穩定。該蛋白中含量最多的為亮氨酸，占12.2%，其次為異亮氨酸和蘇氨酸，各占10.9%和8.6%。含量最少的為谷氨酰胺、谷氨酸、組氨酸、酪氨酸，均為1.8%（圖1）。有研究表明，大部分植物中的LEA蛋白富含賴氨酸、甘氨酸、組氨酸等極性氨基酸，缺乏色氨酸和半胱氨酸，本研究中狗棗獼猴桃色氨酸缺乏，但是存在半胱氨酸，這是狗棗獼猴桃不同于已研究的其他植物的一個特性。

在自然界中常見的氨基酸均具有親水性和疏水性，其排列順序側鏈基因之間的相互作用決定了其合成蛋白質三維空間結構的主要原因，通過測定和分析可以為高級結構的預測提供參考。通過Prot Scale軟件分析預測，結果表明：該基因蛋白的整個肽鏈中均含有親水性和疏水性氨基酸，得分最大值為3.867，在56、57、58個氨基酸處，最小值為-2.600，在第36個氨基酸處。根據蛋白質親水和疏水的得分判定該蛋白為親水蛋白（圖2）。

2.2 AkLEA信號肽和跨膜結構

有些蛋白質合成以后，需要轉移到特定位置發揮作用，信號肽就是引導蛋白質到達特定位置的特殊氨基酸序列，一般位于蛋白質的N端，長約10～30個氨基酸，包含信號肽的C端、N端和疏水核心區。SignalP-4.1預測AkLEA蛋白不含信號肽，也不存在跨膜結構（圖3）。

2.3 狗棗獼猴桃AkLEA功能位點和結構域預測

通過氨基酸序列的比對，對狗棗獼猴桃AkLEA保守序列及蛋白家族進行預測，結果表明，狗棗獼猴桃AkLEA是LEA基因家族的LEA2成員，它的第100～200氨基酸之間的序列區域為LEA2組的保守結構域（圖4）。NCBI-CDD 和Inter-ProtScan預測結果表明，67～221氨基酸為狗棗獼猴桃AkLEA的N端序列，1～39氨基酸為狗棗獼猴桃AkLEA的C端序列。

2.4 AkLEA二級、三級結構預測

用Predictprotein對AkLEA的二級結構進行預測，結果表明，組成AkLEA的221個氨基酸中，其中8.14%的氨基酸可能會形成螺旋（helix），43.44%的氨基酸可能形成延伸鏈（strand），48.42%的氨基酸可能形成環（loop），無二硫鍵的形成，沒有特殊的二級結構。用SWISS-MODEL對AkLEA蛋白進行三級結構的預測，結果如圖5所示。

2.5 蛋白質修飾位點的預測

蛋白質磷酸化是調節和控制蛋白質活力和功能的最基本、最普遍，也是最重要的機制。通過predictprotein分析表明，AkLEA上含有5個糖基化位點（c N-glycosylation site）、7個蛋白激酶C磷酸化位點（Protein kinase C phosphorylation site）、1個酪蛋白磷酸激酶Ⅱ磷酸化位點（Casein kinaseⅡphosphorylation site）、5個十四烷酰化位點（N-myristoylation site）（表1）。

蛋白質的N-糖基化修飾是生物體調控蛋白質在組織和細胞中的定位、功能、活性、壽命和多樣性的一種普遍的翻譯后修飾。通過NetNGlyc1.0 server對N-糖基化位點進行預測，結果表明，該蛋白內有5個潛在的N-糖基化位點，分別在93（NLTV）、146（NMTI）、172（NMSS）、198（NCTM）及204（NATS）氨基酸處。O-糖基化是另一種重要的蛋白質翻譯后修飾，O-糖鏈能維持所連接蛋白質部分的空間構象，NetOGlyc4.0 server對O-糖基化位點進行預測，預測分數均大于0.5的認為是陽性，故推測該蛋白內含3個O-糖基化位點，分別在22、26、108氨基酸處。

表1 AkCHS1蛋白修飾位點的預測

2.6 氨基酸序列同源性對比

在NCBI數據庫中分別下載山黃麻、東方苔草、歐洲栓皮櫟、荷花、中華獼猴桃原變種、蘋果、土瓶草、博落回、可可樹、甜椒、巴卡廷辣椒、番茄、向日葵、香青蒿、楊樹、石榴等17種植物的LEA序列，與狗棗獼猴桃AkLEA氨基酸序列進行同源性分析，結果表明，狗棗獼猴桃AkLEA與中華獼猴桃原變種親緣關系較近，而與楊樹、石榴等植物親緣關系較遠（圖6）。

3 討論

本研究利用已測的狗棗獼猴桃轉錄組數據，篩選出狗棗獼猴桃AkLEA基因cDNA序列信息，并對其進行了生物信息學分析。結果表明，AkLEA基因cDNA總長1 292 bp，CDS為657 bp，編碼蛋白由221個氨基酸構成。具有LEA的保守序列，是LEA2（PLN03160）超家族的一員，是一個親水性、穩定的蛋白。LEA＿2組中的蛋白大多為非典型的LEA蛋白，它們與其他分組之間存在著較低的序列同源關系［10］，AkLEA基因在NCBI數據庫中進行Blast，結果顯示在與狗棗獼猴桃LEA蛋白相比的98條LEA基因的氨基酸序列中，一致性最高的為93.15%，最低的為44.44%。該結果與Galau等的研究結果［10］相符。LEA2分組中的非典型LEA蛋白，與典型的LEA蛋白相比，往往具有較高疏水特性，并且具有較為穩定的結構。典型的LEA蛋白具有較強的親水特性，它們在脫水條件下可以起到親水性溶質的作用，進而維持蛋白結構的穩定。因此，為了鑒定AkLEA基因cDNA序列是否也具有非典型LEA蛋白的這些特性，本研究通過Prot Param在線軟件進行了疏水性鑒定，但是結果預測該AkLEA蛋白為親水性蛋白。這一結果表明了AkLEA蛋白可能擁有不同于非典型的LEA蛋白的功能。選取17條氨基酸序列與狗棗獼猴桃的氨基酸序列進行比對，經MAGA 5.0分析，結果表明，狗棗獼猴桃AkLEA與中華獼猴桃變種親緣關系較近，而與楊樹、石榴等植物親緣關系較遠。