中國大鯢熱激蛋白基因Hsp90的克隆及極端溫度脅迫下的表達研究

李國勇，許抗抗，楊文佳，駱建林，曹 宇，李 燦

（貴陽學院大學科技園/貴州省山地珍稀動物與經濟昆蟲重點實驗室，貴州貴陽 550005）

熱激蛋白（heat shock protein，簡稱Hsp）是細胞或生物體在受到外界環境的刺激（例如高溫、干旱、饑餓、病原物侵入、重金屬離子等）誘導后產生的一類應激性蛋白，它廣泛存在于動物、植物和微生物體內［1-2］。Hsp可以促進蛋白質的正確折疊和組裝，阻止變性蛋白聚體，從而將變性蛋白降解或重折疊，在維持生物體正常的生理代謝活動中起著重要作用。根據分子量大小、同源性和分子能可將熱激蛋白分為6個家族，即 Hsp10、Hsp90、Hsp70、Hsp60、Hsp40和 分 子 量 小Hsp等［3］。

Hsp90蛋白的分子量約為82～90 ku，它是生物體內最豐富的蛋白質之一，在正常情況下約占胞質蛋白的1%～2%。Hsp90家族高度保守，其蛋白質包含3個結構域：N-端保守ATP（腺嘌呤核苷三磷酸）結合結構域、中間結構域和C-端多肽結合結構域。Hsp90具有多種生物學功能，它不僅參與熱害、干旱、高鹽等脅迫響應，還可以參與組裝、穩定和激活轉錄因子、激素受體以及蛋白激酶等關鍵信號蛋白［4］。目前，關于HSP90基因的研究多集中于昆蟲，已有多種昆蟲的Hsp90基因被克隆鑒定。研究發現，這些基因在應對極端溫度、重金屬離子以及殺蟲劑等各類非生物逆境脅迫中發揮著關鍵作用［5-11］。

中國大鯢（Andrias davidianus）俗稱娃娃魚，屬于兩棲綱（Amphibia）有尾目（Caudata）隱鰓鯢科（Cryptobranchidae）大鯢屬（Andrias），是現存個體最大的兩棲動物，為中國珍稀、瀕危物種，是國家二級保護動物，已被列入瀕危野生動植物種國際貿易公約（簡稱CITES公約）附錄Ⅰ中［12-15］。由于大鯢具有極高的營養價值、經濟價值和科研價值，其養殖在中國華中、西南及西北等地區迅速發展，并逐步形成了適度規模化的地方優勢特色。但是受到近幾年來全球氣候變暖的影響，極端天氣也頻繁出現，對大鯢免疫系統的正常運行產生了嚴重影響，從而導致大鯢疾病的頻發。

本研究以高溫、低溫2種極端溫度脅迫下的大鯢為研究對象，分別克隆獲得CgHsp901、CgHsp902這個2個基因的全長序列，分析不同組織中這2個基因的表達變化，試圖了解該基因在大鯢應對極端溫度脅迫中所發揮的作用，為深入開展大鯢繁殖與疾病預防研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料準備與高溫處理

大鯢幼體來源于貴州省大鯢養殖基地，挑選平均體質量為250～300 g的幼體大鯢，用長25 cm、寬10 cm、高13 cm的塑料盆飼養在溫度分別為0、5、15、20、25℃的人工培養箱中，每個溫度梯度飼養1盆共4尾幼體大鯢，飼養時間分別為24、48 h。為了模擬大鯢的洞穴生存環境，培養箱內不開光照燈，試驗重復3遍。處理完成后，統計各溫度下大鯢幼體的存活率，對大鯢的心臟、肝臟、胃、脾、肌肉、皮膚和腸道7個不同組織進行取樣。樣品取出后馬上放入液氮中凍存，然后置于-81℃冰箱中保存備用。

1.2 主要試劑

TRIzol試劑（TRIzol Regent，Invitrogen公司）；反轉錄試劑盒（PrimeScript RT Reagent Kit，TaKaRa公 司）；Taq酶（TaKaRa公司）；膠回收試劑盒（Gel Extraction Kit，Omega公司）；載體（pCEM-T EasyVector，Promega公司）；感受態細胞DH5α（北京全式金公司）；qPCR試劑（Go Taq qPCR Master Mix，Promega公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 大鯢幼體組織總RNA的提取及第一鏈cDNA的合成根據TRIzol試劑盒說明書提取大鯢幼體組織的總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000核酸蛋白濃度測定儀檢測總RNA的完整性和濃度。取1μg總RNA，按照反轉錄試劑盒的操作說明合成第一鏈cDNA，稀釋2倍后保存于-20℃冰箱備用。

1.3.2 Hsp90基因全長cDNA的克隆 根據貴州省山地珍稀動物與經濟昆蟲省級重點實驗室前期測定的大鯢轉錄組數據，利用NCBI（美國國立生物技術信息中心）站點的ORF（開放閱讀框）Finder軟件（http：//www.ncbi.nlm.hih.gov/gorf/or-fig.cgi）對所獲得的Hsp90基因進行分析，發現1個具有完整開放閱讀框的cDNA序列，用Primer Premier 5.0軟件設計特異性引物（表1）進行PCR擴增。RT-PCR反應體系如下：2.5μL 10×PCR緩沖液，2.5μLMgCl2，2μL dNTPs，各1μL上下游引物，1.0μL cDNA，0.25μL Taq酶以及15μL ddH2O。

表1 引物相關信息

擴增條件如下：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸2.5 min，35個循環；72℃延伸10 min。PCR產物經1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測后，利用Gel Extraction Mini Kit回收目的條帶并連接至pGEM-T Easy載體上，再將其轉化到DH5α大腸桿菌感受態細胞中，經藍白斑篩選和PCR鑒定后進行測序驗證。本試驗中所用引物和DNA測序由成都擎科生物技術有限公司完成。

1.3.3 序列分析 利用DNAMAN 6.0（Lynnon Biosoft）對測序結果進行編輯和分析，并采用BLAST（http：//www.ncbi.nlm.gov/BLAST/）工具進行同源性比對分析。利用在線數據庫Prosite（http：//prosite.expasy.org/）分析保守區域。利用ProtParam（http：//web.expasy.org/）和NetNGlyc 1.0 server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）推測該氨基酸序列的理化性質和N-糖基化位點。

1.3.4 Hsp90基因在溫度脅迫下的相對表達量 采用實時定量PCR技術檢測不同溫度脅迫后幼體大鯢Hsp90基因的相對表達量。根據“1.1”節的方法，用不同溫度處理大鯢，分別取7個組織，提取總RNA并反轉錄合成cDNA用于實時定量PCR，每個處理設4次重復。使用在線軟件Primer 3.0（http：//frodo.wi.mit.edu/）設計定量PCR引物，內參基因選取EF1α基因，引物序列信息見表1。PCR反應體系如下：10μLGo Taq qPCR Master Mix、1μL cDNA、7μL nucleasefreewater（去核酸酶的水）和各1μL上下游引物，混勻，輕微離心，放入CFX96TM Real-Time System實時定量PCR儀（Bio-Rad）中進行擴增，反應條件如下：95℃預變性2 min；95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環；于60～95℃進行熔解曲線分析以保證反應的特異性。用2-ΔΔCT方法計算目的基因的相對表達量［16］。

1.4 數據分析

采用SPSS 17.0軟件進行數據分析，應用單因素方差分析（ANOVA）對不同溫度脅迫后大鯢幼體的存活率及其體內Hsp90基因的相對表達量進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 中國大鯢CgHsp901、CgHsp902基因的cDNA克隆及序列分析

采用RT-PCR技術，從中國大鯢體內克隆了熱激蛋白90基因，命名為CgHsp901、CgHsp902。CgHsp901基因cDNA全長為2 619 bp，開放閱讀框為2 388 bp，編碼795個氨基酸；CgHsp902基因cDNA全長3 024 bp，開放閱讀框為2 184 bp，編碼727個氨基酸。2個基因都具有Hsp90家族特有的標簽序列，與其他兩棲動物等物種的Hsp90有較高的同源性。2個基因的理論分子量都為90 ku，等電點分別為4.81、5.32。由CgHsp901推導的氨基酸序列包含Hsp90家族的4個簽名序列：第95～124位的NKEIFLRELISNSSDALDKIR、第161～169位的LGTIAKSGT、第403～412位的IKLYVRRVFI、第429～433位的GVVDSDDLPLNISRE（圖1）。由CgHsp902推導的氨基酸序列包含Hsp90家族的5個簽名序列：第39～59位 的 NKEIFLRELISNSSDALDKIR、第 106～114 位 的LGTIAKSGT、第129～145位的MIGQFGVGFYSAYLVAE、第336～345 位 的 IKLYVRRVFI、第 362～376 位 的GVVDSEDLPLNISRE，以及氨基酸C-端末尾基序MEEVD（圖2）。利用NetNGlyc 1.0 server進行分析可知，CgHsp901存在5個N-糖基化位點，分別為N143、N253、N477、N543和N548；而CgHsp902存在4個N-糖基化位點，分別為N150、N386、N492和N717。

2.2 2個基因在不同溫度脅迫下的應激表達

利用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測這2個基因在中國大鯢心臟、肝臟、胃、胰腺、肌肉、皮膚和腸道7個不同組織中低溫（0、5℃）和高溫（20、25℃）脅迫下mRNA表達量的差異，結果顯示，大鯢幼體經低溫處理24、48 h后，CgHsp901 mRNA的相對表達量在腸道、胰腺、胃和肝臟中不高，甚至在胰腺和肝臟中的部分表達量顯著下調（圖3、圖4）。但在皮膚、肌肉和心臟組織中，CgHsp901 mRNA的相對表達量整體上顯著升高。0℃處理24 h后，CgHsp901 mRNA在皮膚中的相對表達量是同溫度下腸道、胰腺中表達量的400倍，是肝臟組織中表達量的40倍；肌肉、心臟組織中CgHsp901 mRNA的相對表達量同樣升高，但是只有對照組的1～2倍。當處理溫度升高到5℃后，CgHspP901 mRNA在皮膚、肌肉和心臟組織中的表達量較0℃處理時顯著下降。

另外，當大鯢幼體處于20、25℃高溫脅迫時，該基因在大部分組織中的mRNA相對表達量都上調。其中在25℃高溫處理后，其在肌肉、胃、皮膚、心臟和肝臟中的表達量顯著上調。另外，對圖3、圖4比較可以看出，隨著處理時間的延長，CgHsp901基因的mRNA相對表達量沒有明顯升高，說明處理時間長短不影響CgHsp901基因的表達。以上結果說明，高溫、低溫脅迫能夠顯著誘導CgHsp901基因在大鯢體內表達，且mRNA表達量與脅迫程度成正比。

本研究對CgHsp902基因同樣進行了低溫（0、5℃）和高溫（20、25℃）脅迫處理，結果顯示，CgHsp902基因在腸道、胰腺和胃組織中的相對表達量明顯低于其在肌肉、皮膚、心臟和肝臟組織中的表達量。與CgHsp901基因一樣，CgHsp902基因在低溫、高溫脅迫下在皮膚、肌肉、心臟和肝臟中的mRNA相對表達量整體表現為顯著升高，而且表達量比CgHsp901基因高（圖5、圖6）。這同樣說明，高溫、低溫脅迫能夠顯著誘導CgHsp901基因在大鯢體內的表達，且mRNA表達量與脅迫程度成正比。

3 討論

大鯢喜棲息于山澗水深、水質清涼、泥潭水流急湍及巖石空洞較多的山溪中，對溫度變化非常敏感，棲息地氣候溫涼濕潤，年平均氣溫為12～17℃，最冷月平均氣溫2℃以上，最熱月平均氣溫在27℃以下，低溫和高溫暴露都可能造成其感染病菌，甚至死亡，從而影響種群發展［12］。本試驗發現，在0、5℃的低溫及20、25℃高溫下分別處理24、48 h后，并未發現大鯢死亡。在溫度脅迫下大鯢只是將胃中內容物吐出，低溫時不吃不動，高溫時則到處游蕩。從這個結果可以看出，大鯢對短時低溫或高溫環境有較強的適應性。

熱激蛋白可以分為組成型熱激蛋白和誘導型熱激蛋白。組成型熱激蛋白在正常生理條件下的細胞中就大量存在，高溫等刺激不會誘導其大量表達，大多與維持細胞基本生理功能和形態建成密切相關，而誘導型熱激蛋白在正常生理條件下不存在或表達量低，但在高溫等逆境刺激下能被強烈誘導表達，具有保護細胞的功能。熱激蛋白90在海洋魚類適應海水溫度變化以及體內外滲透壓變化等不利條件方面起著重要的作用。熱激蛋白不僅是熱脅迫時大量表達的蛋白，也是其他環境脅迫時大量表達的蛋白，如低溫、干旱、高滲透壓及重金屬等環境因素都能促使生物體表達熱激蛋白。在很多昆蟲種類中，Hsp90得到了大量的研究。然而有關大鯢熱激蛋白方面的研究很少，關于大鯢Hsp90的熱激蛋白基因家族中Hsp90B1、Hsp90AA1基因的研究幾乎未見報道。本試驗利用RT-PCR技術克隆了大鯢的Hsp90 cDNA片段，為進一步明確低溫和高溫脅迫與Hsp90基因表達量之間的相互關系奠定了基礎。本試驗克隆出的CgHsp901、CgHsp902在正常條件下檢測到少量存在于肌肉、皮膚、心臟和肝臟中，而當大鯢在0℃或25℃下脅迫24、48 h后，2個基因在皮膚中的表達量與對照組相比分別上升了5、20倍，說明這2個基因誘導表達的都是誘導型熱激蛋白。而大鯢在低溫、高溫的長時間脅迫下能夠全部存活，很可能是皮膚中CgHsp901、CgHsp902基因上調，在抵抗低溫和高溫脅迫過程中發揮了重要作用，也可以說明在遇到溫度脅迫時皮膚是抵御其影響的第一道屏障。另外肌肉、心臟和肝臟組織在低溫和高溫脅迫下CgHsp901、CgHsp902基因的相對表達量也高于對照組，并且它們的平均值都顯著高于腸道、胃和胰腺組織中的相對表達量。這說明前三者在應對溫度脅迫的時候也發揮了一定的作用，而后面3個組織則不起作用。