黃瓜白粉病拮抗細菌的篩選鑒定及其生防效果

王海利，張曉慷，王瀅秀，韓金濤，張新剛

（山東省農藥科學研究院/山東省化學農藥重點實驗室，山東濟南 250100）

白粉病別稱白毛病，是一種廣泛發生的世界性病害。在我國，夏秋露地和春保護地黃瓜每年都因白粉病的發生造成大量減產［1］。黃瓜白粉病是由葫蘆科白粉菌（Erysiphecucur bitacearum）或單絲殼白粉菌（Sphacrotheca fuliginea）引起的［2］，病原菌主要通過氣流傳播，具有潛育期短、再侵染頻繁、流行性強等特點［3］。目前，防治白粉病的主要手段是化學殺菌劑，但由于白粉病病菌繁殖率很高，同一流行季節可繁殖多代，加之內吸性殺菌劑大多作用位點單一，病菌在藥劑的選擇壓力下極易產生抗藥性，國內外已有黃瓜白粉病病菌對苯并咪唑類、甾醇生物合成抑制劑類（EBIs）、有機磷類、羥基嘧啶類、甲氧基丙烯酸酯類、苯氧基喹啉等6類殺菌劑產生抗藥性的研究報道［4］。隨著環境法規制定普及和公眾環保意識的加強，減少化學農藥的使用，減輕生態環境壓力保持農業可持續發展是未來農業的發展趨勢［5］。

近年來，利用微生物防治黃瓜白粉病的研究國內外均有報道，Romero等研究3種微生物對黃瓜白粉病的防效，結果表明，枯草芽孢桿菌對瓜類白粉病的防治效果接近于2種重寄生菌和醚菊農藥對照［6］。芽孢桿菌作為重要的生防資源已廣泛用于防治植物病害［7-11］。本研究通過對1株具有黃瓜白粉病生防效果的細菌進行初步鑒定，確定其遺傳地位。并對盆栽黃瓜白粉病的防治效果進行試驗驗證，分別與商品化生物農藥進行對比，以期為該產品的進一步開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試黃瓜品種為寶楊5號，為易感病品種，購自上海種子市場。

1.1.2 培養基 菌種分離篩選和活化培養基：3 g牛肉膏，10 g蛋白胨，5 g NaCl，15 g瓊脂，1 000 mL自來水，pH值為7.2～7.4。

種子菌液制備和菌種發酵基礎培養基：3 g牛肉膏，10 g蛋白胨，5 g NaCl，1 000 mL自來水，pH值為7.2～7.4。

1.1.3 對照藥劑 100億CFU/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑，購自美國拜沃股份有限公司。

1.1.4 試驗儀器 主要儀器有搖床、培養箱、潔凈工作臺、高壓滅菌鍋，均購自上海博訊實業有限公司醫療設備廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 拮抗細菌的分離純化 采用梯度稀釋平板涂布法分離黃瓜白粉病根際土壤中的細菌［12］，根據平板上菌落形態、顏色等挑取單菌落進行純培養。

1.2.2 種子菌液的制備 將分離保存的菌種轉接到牛肉膏蛋白胨培養基平板上，在28℃溫度條件下培養48 h進行活化，活化后挑取部分菌落接于裝液量為100 mL的250 mL錐形瓶的種子菌液制備培養基中，30℃，180 r/min振蕩培養48 h即為種子菌液。

1.2.3 發酵液的制備 將發酵好的種子液按5%（體積比）的比例接種到裝有200 mL菌種發酵基礎培養基的500 mL錐形瓶中，30℃，180 r/min振蕩培養72 h備用。

1.2.4 拮抗細菌的篩選 以黃瓜白粉病病原菌為指示菌，采用活體生測法，篩選對其有效的拮抗細菌。在溫室條件下，挑選飽滿的黃瓜種子播種到小花盆里，保濕，置于25℃室溫下光照培養。待黃瓜幼苗長出2張真葉時，挑選長勢一致的黃瓜苗，將分離篩選的細菌發酵液濃度調至1010CFU/mL，噴灑于黃瓜葉片上，待藥液晾干后接種孢子濃度大概為10萬個/mL左右的懸浮液，用接種噴霧器在黃瓜苗上均勻噴霧接種，大概接種2 h（為確定篩選的拮抗細菌是否具有預防效果，于接種白粉病菌前24 h進行發酵液的噴灑）后試材自然風干，然后移至恒溫（24℃左右）室燈光下，培養期間每天保溫、保濕。于1、2周后按黃瓜白粉病的常規分級標準及方法計算病情指數和防治效果，每個處理重復3次。對照藥劑為枯草芽孢桿菌可濕性粉劑，以清水作為空白對照。

醬油主要由大豆、淀粉、和小麥粉經過發酵而成，這些成分在被人體吃下之后都會變成無色的氨基酸和多肽混合物，而其黑色來源于其中所含的焦糖色素，并不會促進黑色素形成也不會沉積在皮膚或傷口上，不必擔心變黑。

1.2.5 生防菌株SDNY-038對黃瓜白粉病溫室盆栽生物活性的檢測 采取盆栽的方法，檢測生防菌株SDNY-038試驗樣品對黃瓜白粉病的活體抑制效果。檢測方法同拮抗細菌的篩選。

1.2.6 生防菌株SDNY-038的鑒定

1.2.6.1 生防菌株SDNY-038的培養性狀與形態特征 在活化培養基上觀察菌株SDNY-038的生長情況，菌落形態采用革蘭氏染色，按常規操作試驗［13］。

1.2.6.2 生防菌株SDNY-038的16S rDNA片段的擴增與序列分析 菌株基因組DNA的提取參照Sambrook等的方法［14］；引物為擴增細菌16S rDNA的通用引物［15］，正向引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物：5′-ACGGCTA CCTTGTTACGACT-3′。PCR產物由山東省農業科學院測序中心進行測序，將結果在GenBank中進行Blast同源序列檢索。采用ClustalX 2.0軟件進行多序列匹配排列，用系統發生推斷軟件包MEGA 3.1轉化成Mega格式后進行系統發育分析。采用Kimura-2-Parameter模型，用鄰接法（neighborjoining，簡稱NJ）法構建系統發育樹，自舉分析10 000次重復檢測分子系統樹的置信度，最后確定菌株SDNY-038的分類地位。

1.3 數據分析

采用Excel軟件進行數據分析以及差異性分析。

2 結果與分析

2.1 拮抗細菌的分離篩選

采用活體生測方法對土壤中分離得到的細菌進行篩選，對黃瓜白粉病致病菌有防效的菌株相對較少，拮抗能力較強的菌株只占2.5%左右，有較弱拮抗作用的菌株占5%，其他均無防效。選取拮抗能力較強的1株拮抗細菌編號為SDNY-038，經過多次復篩，均表現出較好的生防效果，提前2 h噴灑和提前24 h噴灑與清水對照相比均具有顯著性差異，提前2 h噴灑在7、14 d后的防治效果分別為87.45%、87.35%，提前24 h噴灑在7、14 d后的防治效果分別為57.84%、41.70%，提前2 h噴灑比提前24 h噴灑在7、14 d后分別提高29.61、45.65百分點（圖1）。

2.2 生防菌株SDNY-038對黃瓜白粉病盆栽防治效果

盆栽測定結果顯示，對生防菌株SDNY-038在施藥7 d后的噴施效果進行調查，生防菌株SDNY-038的病情指數和防治效果分別為3.31、78.00%，防治效果比陽性對照藥劑高出59.93百分點，14 d后的病情指數和防治效果分別為12.11、84.67%，防治效果比陽性對照藥劑高出66.37百分點，病情指數與防治效果與空白對照相比均呈顯著性差異（圖2）。

2.3 生防菌株SDNY-038的形態特征以及生理生化鑒定結果

生防菌株SDNY-038在基礎培養基上生長迅速，菌落呈圓形，乳白色，不透明，無皺褶，邊緣不規則，菌落表面光滑，濕潤，經革蘭氏染色鑒定為革蘭氏陽性菌，能水解淀粉和還原硝酸鹽，葡萄糖、木糖、甘露糖以及檸檬酸鹽生長試驗反應均為陽性。

2.4 生防菌株SDNY-038的16S rDNA的序列分析和系統發育樹構建

經測序，生防菌株SDNY-038的16S rDNA全長序列為1 471 bp，在GenBank數據庫中進行Blast比對，結合進化樹（圖3）分析，結果顯示其與芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）相關家族親緣關系最為接近，同源性達到99%。結合相關的形態特征以及生理生化鑒定結果，可以初步判斷生防菌株SDNY-038為芽孢桿菌。

3 討論與結論

近幾年，隨著國家對環境安全越來越重視，化學農藥新品種的登記以及產品生產的門檻越來越高，生物農藥的研制成為大勢所趨，發掘高效低毒的生物農藥并不容易，盡管過去幾年人們開發的生物農藥數不勝數，但真正有較好防治效果的產品是少之又少。對黃瓜白粉病具有防效的生防菌在國內外有不少的報道［16-18］，說明生防菌用于黃瓜白粉病的防治具有較大的發掘潛力。

通過對黃瓜白粉病根際土壤菌進行分離純化，以及活體黃瓜白粉生測試驗篩選，發現1株對白粉病具有較好防治效果的生防細菌，通過對該菌株16S rDNA進行鑒定，結合相關的生理生化特征，發現其與芽孢桿菌屬于同一屬，具有較好的預防保護效果，在對幼苗處理7、14 d后的防效分別達到78.00%、84.67%，持效期較長，具有較好的應用開發前景。