硬枝黃蟬提取物對胡椒瘟病病菌的抑菌活性及抑菌活性成分分離

茍亞峰，胡林峰，陳世敏，楊賀賀，孫世偉

（1.中國熱帶農業科學院香料飲料研究所，海南萬寧 571533；2.河南科技學院，河南新鄉 453003）

硬枝黃蟬（Allemanda neriifolia Hook.）是夾竹桃科（Apocynaceae）黃蟬屬（Allemanda）植物，為常綠灌木植物，原產于巴西，在我國亞熱帶地區的廣東、福建、廣西、臺灣等地有引種，現廣泛栽培于熱帶地區，是一種觀賞植物［1］。夾竹桃科植物一般有毒，含有多種類型的生物堿，如夾竹桃苷、蘿芙木堿、長春花堿、軟枝黃蟬苷等，是重要的藥物原料，可治療多種疾病，在農業上用于殺蟲防治。林同等研究發現，硬枝黃蟬花的乙醇提取物對白蟻具有一定的防治效果［2］；馮崗等研究發現，軟枝黃蟬提取物對螺旋粉虱成蟲、椰心葉甲具有一定的毒殺活性［3-4］，但關于其抑菌活性的報道較少。筆者前期對豐富的熱帶植物抑菌活性進行篩選發現，硬枝黃蟬具有較強的抑菌活性，但對具體的抑菌活性成分未進行分離。因此，本試驗以威脅胡椒產業發展的主要病害胡椒瘟病病菌為供試病原菌，研究硬枝黃蟬無水乙醇提取物的萃取組分及其餾分的抑菌活性，以期為進一步分離硬枝黃蟬的抑菌活性物質提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試病原菌 胡椒瘟病病菌（Phytophthora capsici）由中國熱帶農業科學院香料飲料研究所提供，桑利偉等對海南省主產區胡椒瘟病病原進行鑒定，結果顯示，胡椒瘟病由辣椒疫霉（Phytophthora capsici）引起［5］。

1.1.2 供試植物 供試植物硬枝黃蟬全株采自中國熱帶農業科學院香料飲料研究所內及萬寧市文通村內。

1.2 硬枝黃蟬無水乙醇提取物的制備

供試植物硬枝黃蟬樣品前處理和提取均參照馮俊濤等的方法［6］，得到無水乙醇提取物浸膏后，于冰箱中（0～4℃）保存備用。

1.3 硬枝黃蟬提取物不同萃取物的制備

采用液-液萃取法，具體參照筆者之前報道的操作方法［7］進行，分別得硬枝黃蟬乙醇提取物石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯萃取組分浸膏，備用。

1.4 抑菌活性測定方法

采用菌絲生長速率法［8-9］。具體方法如下：稱取0.2 g硬枝黃蟬無水乙醇提取物浸膏，用無菌蒸餾水定容至20 mL，制成濃度為10 mg/mL的無水乙醇提取物母液。再用無菌蒸餾水稀釋制成濃度為5 mg/mL的無水乙醇提取物。然后將培養基融化并冷卻至50℃左右，將4 mL不同濃度的硬枝黃蟬無水乙醇提取物分別與36 mL/瓶的PDA（馬鈴薯葡萄糖瓊脂）培養基混合，搖勻后迅速將其倒入3個直徑為9 cm的培養皿中。待其凝固后，取菌落直徑為6 mm、培養好的各供試病原菌的外層菌塊置于培養皿中央，以加入等體積滅菌水的PDA培養平板為對照，每個處理設3皿重復。接種后，在人工氣候培養箱（溫度為25～28℃）中培養5 d后，采用十字交叉法分別測量菌落直徑（cm），求其平均值，按下式計算菌落直徑和抑菌率：

菌落直徑＝測量菌落直徑平均值-0.6 cm；

抑菌率＝（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100%。

1.5 數據統計分析

采用SPSS數據分析軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 硬枝黃蟬乙醇提取物浸膏的提取率

準確稱取10 kg硬枝黃蟬干粉，采用冷浸提的方法，將濾液減壓濃縮得到770.54 g硬枝黃蟬乙醇提取物浸膏，提取率為7.71%。

2.2 硬枝黃蟬乙醇提取物不同極性段萃取組分抑菌活性的測定

分別采用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯對硬枝黃蟬乙醇提取物浸膏進行萃取，分別得到石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯萃取組分，采用“1.4”節的方法進行抑菌活性的測定。從圖1、表1可以看出，三氯甲烷、乙酸乙酯萃取組分對胡椒瘟病病菌具有較好的抑菌活性，抑菌率分別達到83.40%、96.92%，石油醚萃取組分的抑菌活性較低。因此，下一步將以乙酸乙酯萃取組分為高活性萃取組分，進一步采用硅膠柱層析對其抑菌活性成分進行分離。

表1 硬枝黃蟬乙醇提取物不同萃取組分的抑菌率

2.3 柱層析溶劑洗脫系統的篩選

采用硅膠柱層析對乙酸乙酯萃取組分進行分離時，首先要篩選合適的溶劑洗脫系統。本試驗通過薄層色板，以Rf值在0.1～0.2范圍內的溶劑系統為首選洗脫系統，對常用有機溶劑石油醚、正己烷、乙酸乙酯、乙醇等單一溶劑或混合溶劑進行展板比較，最終選擇石油醚-乙酸乙酯溶劑系統作為硅膠柱層析的洗脫劑。

2.4 抑菌活性成分的分離

在“2.3”節的基礎上，采用的硅膠柱層析以石油醚-乙酸乙酯為溶劑洗脫系統，對硬枝黃蟬乙醇提取物乙酸乙酯萃取組分中的活性成分進行梯度洗脫。設置石油醚、乙酸乙酯體積比＝20∶1、18∶1、15∶1、12∶1、10∶1、8∶1、5∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶5、1∶8、1∶10、1∶12、1∶15、1∶18、1∶20的洗脫梯度。最后用甲醇清柱，每瓶餾分收集200 mL，一共收集229瓶。

采用TLC展板合并相同的餾分，得到AN-01、AN-02、AN-03、AN-04、AN-05、AN-06、AN-07、AN-08、AN-09、AN-10等10種餾分。

2.5 不同餾分抑菌活性的測定

采用“1.4”節的方法對AN-01、AN-02、AN-03、AN-04、AN-05、AN-06、AN-07、AN-08、AN-09、AN-10等10種餾分的抑菌活性進行測定。

從表2可以看出，餾分AN-02、AN-03和AN-04對胡椒瘟病病菌具有一定的抑菌活性，抑菌率分別達到100.00%、100.00%、81.45%。初步確定硬枝黃蟬乙醇提取物對胡椒瘟病病菌的抑菌活性成分集中在這3個餾分中，具體是哪一種化合物有待進一步分離。

表2 不同餾分的抑菌活性測定結果

3 討論

本研究發現，硬枝黃蟬乙醇提取物采用石油醚、三氯甲烷和乙酸乙酯3種溶劑萃取后，三氯甲烷、乙酸乙酯萃取組分對胡椒瘟病病菌的抑菌活性較高，其抑菌率分別達到了83.40%、96.92%，石油醚萃取組分的抑菌率僅為51.38%。進一步對抑菌活性較高的乙酸乙酯萃取組分進行減壓柱層析分離，并采用薄層色板進行展板合并，得到AN-01～AN-10等10個餾分。對分離的10個餾分進行抑菌活性測定，結果顯示，其中AN-02、AN-03、AN-04對胡椒瘟病病菌表現出較高的抑菌活性，抑菌率分別達到了100.00%、100.00%、81.45%。下一步將結合餾分質量和抑菌活性強度對餾分AN-02、AN-03、AN-04中的抑菌活性進行進一步分離，從而為開發研制新型植物源殺菌劑奠定基礎。

目前，已經開始被應用于生產防治植物病害的植物源殺菌劑有大蒜素、苦參堿、根復特、混合脂肪酸、銀杏提取素、低聚糖素、植物激活蛋白、丁子香酚、黃連素、檸檬醛·烯和丙烯酸·香芹酚等［10］。石志琦等報道，蛇床子素具有殺蟲抑菌的雙重作用；2006年石志琦聯合江蘇省蘇科農化有限責任公司開發了首個蛇床子素殺菌劑1%蛇床子素水乳劑，用于替代三唑類、代森錳鋅等殺菌劑，可以減少化學農藥使用量達30%～60%，有效保障了農產品的安全［11］。張曉艷等研究發現，江蘇省農業科學院產地環境與投入品安全研究室研發的20%丁香酚水乳劑對番茄黃化曲葉病毒具有較高的防效［12］。沈陽化工研究院在1997年以天然抗生素為先導化合物研制了1種新型甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑烯肟菌酯，其對瓜類、番茄具有明顯的促進生長和提高品質的作用，用于防治霜疫霉病、蘋果葉斑病和小麥赤霉病等［13-14］。李嘉報道，黃蟬屬植物主要的化學成分為環烯醚萜、木脂素等，其中環烯醚萜內酯成分黃蟬花定、雞蛋花素等具有抗腫瘤和抗真菌的生物活性［15］。Tiwari等研究發現，從軟質黃蟬中分離出的雞蛋花苷顯示出強烈的抗皮膚真菌的活性［16］。因此，在本研究的基礎上，對硬枝黃蟬中的抑菌活性物質有待進一步分離。