羅漢果斑枯病菌主要生物學特性及防治藥劑篩選

蔣 妮，宋利沙，陳乾平，馮世鑫，張占江，蔣水元，黃夕洋

（1.廣西壯族自治區藥用植物園，廣西南寧 530023；2.廣西壯族自治區中國科學院廣西植物研究所，廣西桂林 541006）

羅漢果（Siraitia grosvenorii）為葫蘆科多年生藤本植物，藥用干燥果實，是我國傳統中藥，具有清熱止咳、化痰、潤肺、生津止渴等功效，被《中國藥典》收載［1］。羅漢果還是我國特有的藥食同源植物，果實中含有高甜度且低熱量的羅漢果苷類，作為最佳的天然甜味劑得以廣泛應用并大量出口到歐美、日本等地［2-3］。廣西是羅漢果的主產區及道地產區，全國80%以上的羅漢果產自廣西桂北山區［4-5］。2015年筆者首次報道在桂林等主產區發生一種嚴重影響羅漢果生長的新病害——羅漢果斑枯病，發病率達84.0%，受害植株葉片早期出現凹陷狀斑點，后期葉片枯萎，植株枯死，嚴重影響羅漢果的生長，經鑒定病原菌為子囊菌，霉靈、戊唑醇、咪鮮胺等化學藥劑對病原菌絲的生長有強抑制作用［6］。近3年，筆者所在課題組繼續跟進該病害的田間流行及防治研究，目前該病已成為羅漢果栽培過程中普遍發生、危害嚴重的一種病害。據農戶反饋，推薦使用的霉靈、戊唑醇、咪鮮胺等化學藥劑雖然在一定程度上控制了病害的發生，但須逐年不斷增加濃度及使用次數，部分嚴重發生的果園已開始出現抗藥性。由于羅漢果斑枯病是一種新病害，目前國內關于病原菌的生物學特性尚未見報道。本研究擬對羅漢果斑枯病菌生物學特性進行系統分析，以期為掌握病害的發生規律及有效防治提供科學依據。多年來農藥的研究進展表明，要克服和延緩病原菌的抗藥性，進行藥劑的復配使用，是一項行之有效的措施［7-8］。目前復配混用農藥發展很快，品種較多，表現出了一定的優越性和生命力［9-10］?；谒幉?、食品的安全性及環境友好等方面的考慮，筆者選擇了目前市場上霉靈、戊唑醇、咪鮮胺的混配制劑以及其他廣譜性的混配藥劑進行毒力測定及田間防治試驗，以期為羅漢果斑枯病的有效防治提供理想的混配制劑。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 羅漢果斑枯病病原菌（Stagonosporopsis cucurbitacearum），由筆者所在實驗室分離鑒定并保存。

1.1.2 供試培養基 本試驗選取以下8種培養基作為供試培養基，并參考方中達提供的培養基配方［11］進行配制，培養基分別為PDA（馬鈴薯葡萄糖培養基）、PSA（馬鈴薯蔗糖培養基）、OA（燕麥培養基）、CMM（玉米粉培養基）、PCA（馬鈴薯胡蘿卜培養基）、MA（麥芽糖瓊脂培養基）、CA（查氏培養基）、WA（水瓊脂培養基）。

1.1.3 供試混配制劑 13種混配殺菌劑種類及生產廠家見表1。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同培養基對病原菌菌絲生長的影響 病原菌在PDA培養基上培養5 d，用直徑為6 mm的打孔器在菌落邊緣打取菌齡一致的病原菌餅（以下接種的菌餅均為此方法），分別接種至供試的8種平板培養基中央，每皿放置1塊菌餅，設3次重復，置于28℃霉菌培養箱培養7 d，十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.2 不同碳氮源對病原菌菌絲生長的影響 將不加蔗糖、硝酸鈉的察氏（Czapek）培養基作為基礎培養基，分別稱取等質量的蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、果糖、可溶性淀粉、乳糖作為碳源；蛋白胨、硝酸銨、氯化銨、硝酸鈉、尿素、磷酸二氫銨作為氮源，以無碳、無氮的Czapek培養基作對照，每處理重復3次，接入菌餅后28℃霉菌培養箱培養7 d，十字交叉法測量菌落直徑［12］。

表1 供試藥劑

1.2.3 不同溫度對病原菌菌絲生長的影響 將原菌餅接種在PDA平板中央，接種后的平板分別置于5、10、15、20、25、28、30、35℃的恒溫箱中光照培養，每個處理設3次重復，培養7 d后取出，十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.4 不同pH值對病原菌菌絲生長的影響 用無菌的HCl（1 mol/L）和NaOH（1mol/L）水溶液調節PDA的pH值，使其pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0。將菌餅分別接種至各平板中央，每個處理設3次重復，28℃霉菌培養箱光照培養5 d，用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.5 不同光照對菌絲生長的影響 設置3個光照環境條件：全光照、12 h光照—12 h黑暗交替、全黑暗，將原菌餅分別接入PDA培養基中央，分別移入以上3個光照環境，28℃培養7 d，用十字交叉法測量菌落直徑，每個處理重復3次。

1.2.6 室內毒力測定 根據預試驗結果，將各供試殺菌劑按照有效成分含量用無菌水稀釋成不同濃度梯度的母液，再向PDA培養基中加入已配制好的殺菌劑母液，制成不同濃度梯度的含藥平板，以加入等量的無菌水于PDA培養基作為對照（CK）。將菌餅分別接種至各不同濃度的帶毒平板中央，每個處理設3次重復，28℃霉菌培養箱光照培養7 d，用十字交叉法測量菌落直徑，計算各藥劑的相對生長抑菌率［13］。

1.2.7 田間防治試驗 試驗地選擇在桂林市永?？h羅漢果種植基地，種植的羅漢果品種為永?？h當地品種富農一號，正常水肥管理。根據室內毒力測定結果，選取對羅漢果斑枯病菌毒力較強的殺菌劑進行田間防治試驗，藥劑的使用量以商品使用說明為參考。施藥時間為2018年6月5日第一次施用，后每隔7 d施1次，連續施用3次，以清水為對照。每處理3次重復，每個重復噴施200m2，并于最后一次施藥后10 d進行病害調查。由于該病害為新病害，根據田間調研結果將羅漢果葉枯病分為5級：1級：葉片無病斑；2級：病斑占葉片表面積≤20%；3級：20% ＜病斑占葉片表面積≤50%；4級：50%＜病斑占葉片表面積≤70%；5級：70% ＜病斑占葉片表面積≤100%。每個重復隨機選取50張葉片統計發病級別，計算病情指數及相對防效。

1.2.8 數據分析 采用Excel軟件計算毒力回歸方程和半最大效應濃度（EC50），利用SPSS軟件對試驗數據進行統計分析，采用Duncan's新復極差法進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同培養基對病原菌菌絲生長的影響

由表2可知，羅漢果斑枯病菌在供試的8種培養基上均能生長，其中OA培養基為最適培養基，培養7 d后平均菌落直徑為73.15 mm，顯著大于其他7種培養基，菌絲密集、絨狀、略帶灰綠色。PDA、PSA培養基適宜該菌的生長，平均菌落直徑為65.42、63.66 mm，二者差異不顯著；菌絲體較密集，絨狀，白色。該菌在PCA、MA培養基上生長均較緩慢，菌絲氣生狀，較稀疏。WA培養基為最不宜該菌生長的培養基，培養7 d后平均菌落直徑僅為12.06 mm，菌絲最稀松，菌落幾近透明。

表2 羅漢果斑枯病菌在不同培養基上的生長情況

2.2 不同碳、氮源對病原菌菌絲生長的影響

羅漢果斑枯病菌在不同碳、氮源培養基上的生長情況見表3。該病原菌能利用不同的碳、氮源進行生長，但不同碳、氮源對病原菌的生長有一定的影響。以葡萄糖為碳源的菌落直徑最大，菌絲密集，長勢最好；其次依次為果糖、甘露醇上菌落較大且菌絲較密集，長勢良；麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉上菌絲相對稀疏，菌落直徑也顯著小于上述3種碳源；而在無碳源培養基中菌落長勢最弱，菌絲稀疏，可見碳源對于該菌的生長具有促進作用。羅漢果斑枯病菌在以蛋白胨為氮源的培養基上菌落直徑最大，長勢最好；在以硝酸銨、氯化銨為氮源的條件下次之；以磷酸二氫銨為氮源的菌落直徑小于供試的其他5種氮源，且菌絲生長稀疏；無氮培養基上菌落直徑最小，菌株生長最弱，菌絲稀薄，說明氮源對于該菌的生長具有促進作用，蛋白胨為最適宜的氮源。

表3 羅漢果斑枯病菌在不同碳、氮源培養基上的生長情況

2.3 不同溫度對病原菌菌絲生長的影響

溫度對羅漢果斑枯病菌生長的影響見圖1，該病原菌可在5～35℃溫度范圍內生長；溫度達到40℃時，接種菌餅直徑6 mm沒有變化，說明菌落沒有生長；5、35℃條件下雖然能生長但生長極緩慢；25～30℃溫度范圍內病原菌生長較好，其中28℃為羅漢果斑枯病菌的最適生長溫度，此時菌落直徑最大，生長狀況最佳。

2.4 不同pH值對病原菌菌絲生長的影響

pH值對羅漢果斑枯病菌生長的影響見圖2，在pH值為4.0～10.0的條件下，該病原菌均能生長；pH值為6.0～8.0時菌落直徑較大，病菌生長較好，其中最適pH值為7.0～8.0，此時，菌落直徑最大，長勢最佳。

2.5 不同光照對菌絲生長的影響

試驗結果（表4）表明：全光照條件下，菌落的直徑最大；12 h光照—12h黑暗交替時，菌落直徑次之；全黑暗不利于菌絲生長，菌落直徑最小。說明全光照有利于羅漢果斑枯病菌菌絲的生長。

2.6 13種混配殺菌劑對羅漢果斑枯病菌的毒力測定

表4 不同光照條件對羅漢果斑枯病菌生長的影響

表5結果表明，供試的13種殺菌劑對羅漢果斑枯病菌均有不同程度的抑制作用。其中45%戊唑·咪鮮胺EC50為0.25，對病原菌的毒力最強；30%甲霜·霉靈、10%苯醚·甲環唑、60%吡萘·嘧菌酯、40%氟嘧菌酯·丙硫菌唑、45%吡醚·甲硫靈，這4種殺菌劑的毒力較強，EC50值為0.72～2.56 mg/L；12%苯甲·氟酰胺、43%氟菌·肟菌酯對病原菌的毒力相對較弱，EC50值分別為85.08、112.47。根據室內毒力測定結果，將毒力較強的（EC50＜5.0 mg/L）5種殺菌劑（45%戊唑·咪鮮胺、30%甲霜·霉靈、10%苯醚·甲環唑、60%吡萘·嘧菌酯、40%氟嘧菌酯·丙硫菌唑、45%吡醚·甲硫靈）進行大田試驗。

2.7 田間防治試驗

由表6可知，在田間施用供試的5種混配殺菌劑對羅漢果斑枯病均具有防治作用，其中45%戊唑·咪鮮胺、40%氟嘧菌酯·丙硫菌唑的防治效果最好，防效分別為86.20%、84.95%；其次是10%苯醚·甲環唑、60%吡萘·嘧菌酯，防效分別為80.63%、80.44%；防治相對較差的是30%甲霜·霉靈，防效為76.58%。從試驗結果來看，45%戊唑·咪鮮胺、10%苯醚·甲環唑、60%吡萘·嘧菌酯的防治效果與其毒力測定的結果都基本吻合；而30%甲霜·霉靈在毒力測定中其毒力僅次于45%戊唑·咪鮮胺，但在田間的防治效果卻顯著低于其他4種殺菌劑。

表5 13種混配殺菌劑對羅漢果斑枯病菌的毒力

表6 不同混配殺菌劑防治羅漢果斑枯病田間藥效

3 結論與討論

羅漢果斑枯病是羅漢果道地產區發生的一種新病害，目前在病原菌生物學特性及侵染規律尚未明確的情況下，無法有效開展防控。為此，項目組在前期病原菌準確鑒定的基礎上，首先開展了病原菌的生物學特性研究，從不同培養基、不同碳氮源、不同溫度、不同pH值、不同光照條件等方面開展了羅漢果斑枯病菌的生物學特性研究。結果表明該病原菌以OA培養基為最適培養基。不同碳、氮源對病原菌的生長有一定的影響，以葡萄糖、蛋白胨為最適碳、氮源。病原菌在5～35℃內均可生長，28℃為最適生長溫度，氣溫超過30℃時菌絲生長速率下降，說明該菌對高溫敏感，這與該病害在田間表現出來的6—7月份為發病高峰，8—9月份發病有所減輕，10月份后又有所加重的發病規律吻合。病原菌生長最適pH值為7.0～8.0，表明該病原菌適宜在稍偏堿的環境中生長。全光照有利于羅漢果斑枯病菌菌絲的生長。13種殺菌劑的室內毒力測定結果表明，對羅漢果斑枯病菌毒力較強的前5種殺菌劑，按照強弱依次為：45%戊唑·咪鮮胺、30%甲霜·霉靈、10%苯醚·甲環唑、60%吡萘·嘧菌酯、40%氟嘧菌酯·丙硫菌唑。而田間防效高低依次為：45%戊唑·咪鮮胺、40%氟嘧菌酯·丙硫菌唑、10%苯醚·甲環唑、60%吡萘·嘧菌酯、30%甲霜·霉靈。對比可見田間防治試驗的結果與毒力測定結果存在一定差異，此種差異，在其他殺菌劑防治其他植物病害上也有類似的報道［14］，分析原因可能是田間藥效受寄主、病原菌、環境條件等多種因素制約。45%戊唑· 咪鮮胺、40%氟嘧菌酯·丙硫菌唑、10%苯醚·甲環唑、60%吡萘·嘧菌酯具有較好的推廣應用潛力，然而，為進一步明確防治效果，仍須開展連年多點田間試驗。