避雨栽培對梨樹開花及成花基因表達的影響

韓金龍，童曉利，曹榮祥，蔣立奔，闞家亮，李 慧

（1.江蘇丘陵地區(qū)南京農(nóng)業(yè)科學研究所，江蘇南京 210046；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室，江蘇南京 210014）

梨是我國主栽的三大果樹之一，在南北方均有栽植。隨著氣候變暖，極端天氣增多，春季寒潮時有發(fā)生，影響梨樹成花率和成花質(zhì)量，嚴重制約了我國梨產(chǎn)業(yè)的發(fā)展［1］。梨樹設施栽培可通過改變光照、溫濕度等生態(tài)因子，促進梨樹的物候期提前［2］，減少不良氣候因子的影響，從而改善梨果實品質(zhì)，提早上市。避雨栽培是果樹設施栽培中的一種集約化栽培方式［3］，主要是在果園搭建聚乙烯塑料薄膜固定式避雨設施。目前避雨栽培在葡萄［4］、大櫻桃［5］、芒果［6］等樹種上均有相關研究，研究主要集中在果樹病害防控和果實品質(zhì)提優(yōu)等方面，對果樹成花影響的報道較少。

溫度是調(diào)節(jié)果樹物候期最重要的影響因素［7-9］。研究表明，花芽萌發(fā)期的環(huán)境變化與成花質(zhì)量具有密切關系［10］。果樹開花期前1個月對平均溫度的變化最為敏感［9］。而土壤濕度直接決定開花時間和花芽萌發(fā)狀況［11-13］。除此之外，物候期也與降水量的多少有一定的相關性［14-16］。通過改善果樹樹冠層的溫濕度、土壤濕度及光照強度，可影響樹體的營養(yǎng)生長和生殖生長。因此，利用避雨栽培設施，改變梨樹生長微環(huán)境，可影響梨樹成花。

果樹成花要經(jīng)過花芽分化期、花芽休眠期和花芽萌發(fā)期3個階段，每個階段的轉變都會受到一系列基因的表達調(diào)控，而開花過程也需要相關基因的啟動與調(diào)節(jié)［17］。LEAFY（LFY）基因和FLOWERING LOCUST（FT）基因是模式植物花器官轉化的關鍵基因，對植物成花起著正相關調(diào)控作用［18］。目前，在蘋果、桃和葡萄等果樹上已分離出成花相關基因，它們在不同花器官中起著調(diào)控果樹成花的作用［19-21］。在梨上亦分離出LFY和FT的同源基因，但僅局限于花芽分化階段的研究［22］，對它們在梨樹開花過程中的具體表達特點尚不清楚。本研究通過比較露地和避雨2種栽培條件下梨園微環(huán)境的差異，分析花芽外觀形態(tài)特征與相關成花基因的表達特點，明確避雨栽培對梨樹成花情況與開花質(zhì)量的影響，為梨樹在南方地區(qū)避雨栽培模式的推廣提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料處理

試驗在江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學研究所果園基地進行，供試材料為以杜梨為砧木，生長健壯、生長勢基本一致的5年生蘇翠1號和翠冠梨品種，株行距3 m×5 m，采用紡錘形樹形。試驗分2個處理：（1）果園露地栽培梨樹；（2）果園避雨栽培梨樹（避雨設施高6 m，只在下雨天進行避雨）。從花芽萌動期到謝花期每周采樣2次，每次每個品種每種處理隨機采集20個花芽，12個用于花芽外觀形態(tài)特征觀察，8個立即用液氮處理保存，用于花芽相關成花基因表達分析。

1.2 試驗方法

1.2.1 果園生態(tài)因子記錄 從2017年3月初（花芽萌動期）開始至2017年4月中下旬（落花期），用空氣溫濕度自動記錄儀和土壤濕度記錄儀分別記錄果園露地與避雨設施下空氣溫濕度（樹冠層）和土壤濕度變化，每隔2 h記錄1次，分析空氣日平均溫濕度、平均土壤濕度及其日變化規(guī)律。

1.2.2 梨成花率統(tǒng)計 從花芽萌動開始，每種栽培模式下每個梨品種在相同的方位隨機選取新梢10枝，固定標記編號，分別統(tǒng)計成花率和開花率，計算公式如下：

成花率＝∑（花芽數(shù)/總芽數(shù)）/重復數(shù)×100%；

開花率＝∑（開花數(shù)/花芽數(shù)）/重復數(shù)×100%。

1.2.3 花芽外觀形態(tài)特征觀察 每周選取周一和周四2天觀察比較不同栽培模式下，花芽萌發(fā)階段的梨花芽外觀形態(tài)特征。

1.2.4 成花基因（LFY、FT）的表達分析 采用改良的CTAB法提取梨花芽的總RNA，用1%瓊脂糖膠檢測RNA質(zhì)量，并利用核酸分析儀NanoDrop（Thermo）檢測濃度，于-70℃保存?zhèn)溆谩Ｒ?μL總RNA為模版，參照AceQ qPCR SYBR Green Master Mix（南京諾唯贊生物科技有限公司）說明書，反轉錄合成cDNA，并以qPCact基因［23］為內(nèi)參基因，進行熒光定量PCR檢測目的基因［22］的表達水平（引物序列見表1）。qPCR反應進行3次技術重復，定量結果采用2-ΔΔCT方法進行分析。

表1 熒光定量PCR所用引物

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 采用Microsoft Excel 2016軟件進行數(shù)據(jù)處理和圖表繪制，SPSS軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 不同栽培模式下溫濕度變化

2.1.1 空氣溫度變化規(guī)律 由圖1可以看出，避雨栽培對梨園溫度變化影響較小。自花芽萌動期到謝花期，隨著時間的推移，2種模式下空氣溫度整體的變化趨勢表現(xiàn)一致，氣溫不斷升高，且避雨條件氣溫較露地條件平均高0.19℃。圖2顯示，避雨和露地條件下氣溫日變化都表現(xiàn)為06：00“低—高—低”的變化趨勢，一天中氣溫最高出現(xiàn)在14：00，最低出現(xiàn)在06：00；從夜間00：00到14：00，避雨條件氣溫較露地條件平均高0.19℃，其中10：00的氣溫相差最大（避雨條件較露地條件高0.74℃），但差異不明顯。

2.1.2 空氣濕度規(guī)律 由圖3可知，從花芽萌動到謝花階段，避雨和露地條件下空氣濕度變化趨勢完全一致，且避雨條件較露地條件日空氣相對濕度相差2.0%～8.8%（平均高5.1%）。圖4顯示，避雨和露地條件下，空氣相對濕度呈現(xiàn)中午低、早晚高的現(xiàn)象，其中最高出現(xiàn)在06：00，最低出現(xiàn)在14：00。一天中避雨條件較露地條件空氣相對濕度相差1.9%～10.2%（平均高5.3%），其中在10：00相差最大，在18：00相差最小。

2.1.3 土壤濕度規(guī)律 避雨和露地條件下，土壤相對濕度變化如圖5所示，從花芽萌動期到謝花期，避雨和露地條件下的土壤相對濕度出現(xiàn)相同趨勢的波動，避雨條件較露地條件土壤相對濕度平均高3.7%，但兩者之間的差距在逐漸減小。圖6顯示，一天內(nèi)避雨條件下的土壤相對濕度變化較為平緩，相差最大僅為0.7%，露地條件下的土壤相對濕度總體變化呈先升高后降低的趨勢，相對濕度最大出現(xiàn)在14：00，最小出現(xiàn)在04：00，兩者相差2.6%。

2.2 不同栽培模式下梨成花狀況比較

2.2.1 梨成花率和開花率比較 由表2得知，避雨條件和露地條件對梨樹形成總芽數(shù)的影響不明顯，但是對花芽的形成（成花率）及開花質(zhì)量存在差異性影響。避雨條件下，蘇翠1號和翠冠的成花率分別達到了78.3%和54.9%，較露地條件提高了5.6百分點和7.4百分點；在開花率方面，避雨條件也較露地條件分別提高了17.6百分點和4.5百分點。這表明避雨栽培對梨樹新梢總芽數(shù)的形成無明顯影響，但能有效提高梨樹的花芽形成率及開花率。

2.2.2 花芽萌發(fā)外觀形態(tài)特征比較 由圖7可知，在相同的栽培條件下，蘇翠1號物候期較翠冠提前，蘇翠1號花芽發(fā)育較翠冠花芽早，但2種梨花芽形態(tài)外觀差異逐漸減小，且開花期一致。在不同栽培模式下，同一品種梨花芽的萌發(fā)過程存在差異，即避雨栽培較露地栽培的梨物候期提前；避雨栽培梨花芽花序分離期較早且花柄伸長較快；從3月23日到3月30日，避雨栽培的梨花柄明顯較露地栽培的長且分離角度大，整個形態(tài)特征也較露地栽培大。隨后避雨栽培梨較露地栽培提前進入開花期，比較梨花形態(tài)可知，避雨栽培梨與露地栽培梨落花期（4月13日）無明顯差異，避雨栽培使梨開花周期延長。

表2 2種梨在不同栽培模式下開花率調(diào)查

2.3 成花基因表達情況比較

2.3.1 PbLFY基因的表達分析 由圖8可知，在梨花芽萌動到落花過程中，不同栽培模式下PbLFY基因在不同品種中的表達變化趨勢相同。在花芽萌動期到開花前（3月6日到3月30日），PbLFY基因在蘇翠1號和翠冠中均呈現(xiàn)表達下調(diào)趨勢，且PbLFY基因在蘇翠1號中的表達量始終高于翠冠；在花柄伸長及花蕾分離期（3月27日到3月30日）該基因表達量始終維持在較低水平。在開花期（4月6日至4月13日），PbLFY基因在2個品種中表達量均上調(diào)，蘇翠1號的表達高峰出現(xiàn)在4月10日，翠冠的表達峰值出現(xiàn)在4月13日，2個梨品種在避雨栽培模式下PbLFY基因表達峰值分別是露地栽培的1.86倍和2.01倍，這表明PbLFY基因可能參與了花芽早期萌動的進程，不參與梨花器官成熟的調(diào)控，且對梨開花過程起正調(diào)控作用。

2.3.2 PbFT基因的表達特點 由圖9可知，PbFT基因在梨花芽萌動到落花過程中，在不同栽培模式下的表達變化趨勢相似，表達量均呈現(xiàn)“升高-降低-升高-降低”的過程，且整個花期物候期，PbFT基因在避雨栽培條件下的表達量始終高于露地栽培。在花芽萌動初期，PbFT基因的表達量維持在一個穩(wěn)定的水平；在花序即將分離時，PbFT基因的表達量出現(xiàn)第1個表達高峰，此時2個梨品種在避雨栽培模式下的PbFT基因表達量分別為露地栽培的1.39倍和1.92倍，蘇翠1號出現(xiàn)在3月16日，翠冠出現(xiàn)在3月20日，隨后其表達短暫下調(diào)，在花序分離后期（3月27日），PbFT基因在蘇翠1號和翠冠中的表達量同時達到峰值，且避雨栽培模式下的PbFT基因表達量分別是露地栽培的1.53倍和1.50倍，之后PbFT基因的表達呈現(xiàn)下調(diào)趨勢，并維持在較低水平。這表明，PbFT基因可能參與了花芽萌動初期調(diào)控，對花序分離及花柄伸長有正相關調(diào)控作用；該基因在蘇翠1號中的調(diào)控啟動早于翠冠。

3 討論

避雨栽培通過搭建聚乙烯篷布來改善梨樹生長微環(huán)境，既可以為梨樹生長提供一個相對穩(wěn)定的環(huán)境，也可防御春季寒潮造成的經(jīng)濟損失，避免外界不利環(huán)境因子帶來的影響。開花是一個復雜的形態(tài)建成過程，是外界環(huán)境和內(nèi)部因子共同協(xié)同作用的結果［24］。本研究發(fā)現(xiàn)，避雨條件可以改善果園微環(huán)境，日平均溫度較露地條件高0.2℃左右，日空氣平均濕度較露地條件高5.1%，日土壤平均濕度較露地條件高3.7%，這與李延菊等對大櫻桃避雨栽培的研究結果［5］相似，即避雨栽培模式能夠提高空氣溫濕度及土壤濕度。而在梨樹開花前，空氣溫濕度的提高有利于延長花粉壽命，促進花粉萌發(fā)、花粉管生長，進而提高果實的座果率［25］。因此，梨樹開花質(zhì)量對提高果園經(jīng)濟效益起著至關重要的作用。比較2種模式下蘇翠1號和翠冠梨的成花率和開花率后發(fā)現(xiàn)，避雨栽培能夠有效提高它們的成花率（分別提高5.6百分點和7.4百分點）和開花率（分別提高為17.6百分點和4.5百分點）。這表明避雨栽培可通過改善果園微環(huán)境，從而提高梨樹的成花率和開花率。

觀察梨花芽萌動始的整個開花過程后發(fā)現(xiàn)，避雨栽培能夠促進梨花期物候期提前［1］，延長開花周期［2］，這可能與避雨栽培可改善果園微環(huán)境有直接關系。梨園微環(huán)境的改變有效誘導了梨成花相關基因PbLFY和PbFT的表達。研究表明，PbLFY和PbFT基因都表現(xiàn)促進成花的作用，只是促進成花的時期有所不同［22］。本研究發(fā)現(xiàn)，梨相關成花基因PbLFY在梨開花前（3月30日前），在不同栽培條件下的梨花芽中的表達量均呈逐漸降低趨勢；在梨花期（4月6日至4月13日），PbLFY基因表達上調(diào)，其中在蘇翠1號中表達量呈先上調(diào)后下調(diào)的趨勢，在翠冠中表達量則呈現(xiàn)持續(xù)上調(diào)，且在此期間避雨條件下表達量均明顯增加。這表明，避雨條件能明顯提高梨相關成花基因PbLFY在開花期間的表達量，這可能是避雨條件能夠延長梨開花周期的原因［26］。梨相關成花基因PbFT在整個花期的表達量會出現(xiàn)2個表達高峰，且避雨條件下的表達量均明顯高于露地條件，這表明基因PbFT在梨開花過程中起著正調(diào)控作用［27］，也是導致避雨條件下花期物候期提前的原因；基因PbFT在蘇翠1號和翠冠中的表達量分別在3月16日和3月20日達到第1個小高峰，這與它們進入花蕾分離期的時間相吻合，表明基因PbFT對梨花芽花蕾分離起正調(diào)控作用，與花器官的成熟密切相關［22］。

綜上所述，避雨栽培能夠提高梨園空氣溫濕度和土壤濕度，有效改善梨園微環(huán)境，促進梨相關成花基因PbLFY和PbFT的轉錄水平上調(diào)，促進整體物候期提前，延長開花周期，提高梨成花率、開花率及改善花生長狀況。