金釵石斛總黃酮提取工藝優化及抗氧化活性

高華山，陳明輝，齊 光，張 科，佟偉霜

（平頂山學院，河南平頂山 467000）

金釵石斛（Dendrobium nobile Lindl.）是蘭科石斛屬植物，又名金釵石、扁黃草等，是《中華人民共和國藥典》［1］收錄的名貴石斛屬藥用植物之一，具備潤肺止咳、明目強身、生津益胃等功效。金釵石斛，性微寒，味甘，用于治療熱病傷津、口干煩渴、病后虛熱、目暗不明、萎縮性胃炎、淺表性胃炎、慢性結腸炎等，是石斛夜光丸、石斛明目丸、石斛浸膏溶液、石斛清胃散等制劑的重要配伍［2］。作為傳統中藥，金釵石斛近年來受到國內外學者高度關注，藥理研究表明，金釵石斛具有提高腸道功能［3］、改善記憶衰退［4］、抗腫瘤［5］、抗誘變［6-7］、增強機體免疫能力及降血糖等作用［8-9］。近幾十年來，國內外學者對許多種石斛的化學成分進行了研究，發現該屬植物所含的化學成分種類豐富，主要包括生物堿類、多糖類、酚類、黃酮類、聯芐類、倍半萜類、香豆素以及甾體糖苷類化合物等［10］，其中以生物堿和多糖為研究對象的工作較多。陳志國等對金釵石斛多糖進行了體外抗氧化活性研究，結果表明，金釵石斛粗制多糖和精制多糖均有一定的抗氧化能力［11］。費雯等研究了金釵石斛總多酚的體外抗氧化活性，結果表明金釵石斛總多酚對ABTS、DPPH自由基和羥基自由基活性均有不同程度的清除作用，其清除能力與總多酚質量濃度呈正相關，具有良好的抗氧化能力［12］。但是，目前對于其黃酮類成分的制備工藝及相關活性研究的較少。因此本試驗在前期研究基礎上采用超聲波輔助提取法提取金釵石斛總黃酮并應用響應面法對總黃酮提取工藝影響較大的4個因素即料液比、提取溫度、提取時間、乙醇體積分數進行優化，從而獲得經濟、科學的提取條件。以維生素C為陽性對照，考察金釵石斛總黃酮對ABTS、DPPH自由基和羥基自由基的清除作用，以期為進一步探討其藥理活性和開發利用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 儀器

UVmini-1240紫外可見分光光度計，日本島津生產；KQ3200B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司生產；SHB-ⅢS型循環水式多用真空泵，鄭州長城科工貿易有限公司生產；旋轉蒸發儀，上海廣英公司生產；102-1型恒溫鼓風干燥箱，永興儀器有限公司生產。

1.2 材料

金釵石斛，購自平頂山張仲景大藥房，藥材干燥后粉碎過80目篩，貯存備用；蕓香苷標準品，北京中科質檢技術有限公司生產；DPPH（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical），西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司生產；ABTS自由基［2，2′-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate）］，上海金穗生物科技有限公司生產；羥自由基試劑盒，南京建成生物工程研究所生產；維生素C標準品，北京中科質檢技術有限公司生產；其他試劑均為國產分析純。

1.3 測定方法

1.3.1 金釵石斛總黃酮的提取與測定 準確量取2.0 g乙醇作為溶劑，在一定溫度下利用超聲波處理一定時間，趁熱抽濾，用相應的提取溶劑補足損失，作為待測液。精確量取1.0 mL待測液于10 mL的比色管中，按標準曲線的測定方法測定待測液的吸光度，計算黃酮含量。公式如下：

式中：C為待測液中的黃酮濃度，mg/mL；V為黃酮提取液體積，mL；N為待測液的稀釋倍數；m為金釵石斛樣品干質量，取2.0 g。

1.3.2 標準曲線的繪制 精確稱取蕓香苷對照品20.0 mg，置于100 mL容量瓶中，用95%乙醇溶解，再用50%乙醇稀釋至100 mL，得0.2 mg/mL蕓香苷對照品溶液，分別量取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL蕓香苷對照品溶液于6個10 mL比色管中，分別加入50%乙醇溶液使之成5 mL，加入5%NaNO2溶液0.3 mL，搖勻后放置6 min，加入10% Al（NO3）3溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，再加入1 mol/L NaOH溶液4 mL，分別用50%乙醇稀釋至10 mL，搖勻后放置15 min，用不加蕓香苷對照品溶液的第1支管作空白，用紫外可見分光光度計在510 nm處測其吸光度，以吸光度為縱坐標、蕓香苷濃度為橫坐標，繪制標準曲線［13］，得y＝13.12x+0.042 6，r2＝0.999 9。結果表明，蕓香苷在濃度0.02～0.10 mg/mL范圍內與吸光度具有良好的線性關系。

1.4 試驗方法

1.4.1 精密度、重復性、穩定性與精確度試驗 精確量取供試品溶液1 mL，按“1.3.2”節中的測定方法操作，測定吸光度，連續測6次，吸光度的RSD＝1.03%，說明儀器精密度較好。將供試品溶液分別放置0、2、4、8、12、24 h后，測定總黃酮含量，結果顯示其RSD＝3.13%（n＝6），說明供試品溶液在24 h內的穩定性較好。按“1.3.1”節中總黃酮的提取方法平行制備6份樣品，按“1.3.2”節的測定方法操作，測定吸光度，結果吸光度的RSD＝2.42%，表明該測定方法的重復性良好。精確稱取6份已知含量的樣品粉末2.0 g，分別加入一定量的蕓香苷對照品溶液（0.2 mg/mL），按“1.3.1”節總黃酮的提取方法制成待測液，再按“1.3.2”節的方法測定吸光度，計算含量及回收率，其平均回收率為92.5%（RSD＝3.60%，n＝6），表明該方法準確度良好。

1.4.2 金釵石斛總黃酮單因素試驗提取工藝優化 以超聲法提取金釵石斛總黃酮，考察料液比、提取溫度、提取時間、乙醇體積分數對金釵石斛黃酮提取的影響。

2 結果與分析

2.1 單因素對金釵石斛黃酮提取量的影響

2.1.1 料液比對黃酮提取量的影響 準確稱取金釵石斛粉末2.0 g，以體積分數為60%乙醇、溫度為55℃條件下浸提30 min，考察1 g∶10 mL、1 g∶20 mL、1 g∶30 mL、1 g∶40 mL、1 g∶50mL 5種不同料液比條件下對黃酮提取量的影響。從圖1-A可以看出，金釵石斛黃酮提取量隨溶劑的增加呈先增大后降低的趨勢，料液比在1 g∶20 mL時，黃酮提取率達到最大值，之后隨溶劑的增加而呈現平緩下降趨勢。原因可能是料液比在1 g∶20 mL時，溶劑中黃酮的溶解度已經趨于飽和，即使繼續增加溶劑用量，黃酮提取量也沒有顯著提高，故選最佳料液比為1 g∶20 mL。

2.1.2 溫度對黃酮提取量的影響 準確稱取金釵石斛粉末2.0 g，以體積分數60%乙醇、料液比1 g∶20mL浸提30min，考察45、55、65、75、85℃5種不同溫度條件下對黃酮酚提取量的影響。從圖1-B可以看出，在溫度未達到65℃時，黃酮提取量隨溫度升高不斷升高；溫度超過65℃后，黃酮提取量隨溫度升高反而下降。這可能是由于溫度小于65℃時，物料的黏滯度減小，黃酮物質很容易溶解析出，黃酮提取量隨溫度升高而增大，至65℃時達到最高，而溫度超過65℃時，較高的溫度可能會破壞黃酮結構造成其提取量下降，故而選擇提取溫度為65℃左右較為合理。

2.1.3 提取時間對黃酮提取量的影響 精確稱取金釵石斛粉末2.0 g，在體積分數60%乙醇、料液比1 g∶20 mL、溫度55℃條件下考察10、20、30、40、50 min 5種不同提取時間對黃酮酚提取量的影響。從圖1-C可以看出，黃酮提取量隨著時間延長反而呈現逐漸下降趨勢，在提取時間為10 min時，黃酮提取量最高；提取20～30 min，黃酮提取量下降較快，在30～50 min時基本保持不變。10 min時黃酮提取量最高且節約時間，故而選取提取時間為10 min左右。

2.1.4 乙醇體積分數對黃酮提取量的影響 準確稱取金釵石斛粉末2.0 g，在料液比1 g∶20 mL、溫度55℃條件下浸提30 min，考察50、60、70、80、90% 5種不同乙醇體積分數下對黃酮酚提取量的影響。從圖1-D可知，黃酮提取量隨乙醇體積分數的增加呈現先升高再降低的趨勢，在乙醇體積分數達到80%時達到最大。這可能是因為隨著乙醇體積分數的增加，材料細胞的溶脹增強，促進提取試劑有效地向細胞內滲透，從而增加提取率［14］。另外可能是由于金釵石斛黃酮類化合物的結構較為復雜，隨著乙醇體積分數的提高，與醇類極性相似的黃酮類物質析出更多，溶劑極性過大或過小對總酚提取均有一定影響。從本試驗結果來看，當乙醇體積分數為80%時，黃酮提取量達最大值，故選取乙醇體積分數為80%左右。

2.2 金釵石斛總黃酮提取響應面試驗設計及優化

2.2.1 響應面試驗設計 根據單因素試驗結果，由Design-Expert8.0.6統計分析軟件設計出試驗方案，以金釵石斛黃酮提取量為響應值，以料液比（X1）、提取溫度（X2）、乙醇體積分數（X3）為自變量，建立4因素3水平中心組合試驗設計共包括17個試驗方案，其中12個析因試驗點、5個中心試驗點，用以計算試驗誤差。因素水平分析選取見表1，試驗設計及結果見表2。

2.2.2 回歸方程擬合及方差分析 應用Design-Expert 8.0.6對表2中的數據進行二次多元回歸擬合，得到料液比X1、提取溫度X2、乙醇體積分數X3與金釵石斛總黃酮含量之間的二次多項回歸方程為：Y＝0.51+0.022X1+0.027X2+0.029X3-0.045X21-0.024X22-0.043X23-0.028X1X2-0.036X1X3+0.041X2X3，R2＝0.995 6，＝0.990 0，由方差分析可知回歸方程模型極顯著（P＜0.000 1），說明該模型與實際擬合良好，試驗方法可靠，失擬項P值為0.074 8＞0.05，不顯著，說明所得方程與實際擬合中非正常誤差所占比例小，可以用該回歸方程代謝試驗真實點對試驗結果進行分析。結果表明，料液比（X1）、提取溫度（X2）、乙醇體積分數（X3）對總黃酮提取量的工藝影響極顯著；二次項料液比、提取溫度、乙醇體積分數對總黃酮提取量的曲面效應均極顯著；比較各因子間料液比與乙醇體積分數交互項、提取溫度與乙醇體積分數交互項對響應值影響顯著，各因素對響應值顯著性的排序為X3＞X2＞X1。

表1 響應面法試驗因素水平編碼

表2 中心試驗設計及試驗結果

2.2.3 各因素的交互作用 將其中1個因素固定在0水平，經軟件Design-Expert 8.0.6獲得其他2個因素交互作用和對金釵石斛黃酮量的影響?！?D”圖坡度越大越陡峭，說明二者交互最有越強；等高線的想著趨向于橢圓且橢圓軸線與坐標軸的角度越大，交互作用越明顯。由圖2可知，響應面坡度陡峭，等高線呈橢圓，說明料液比（X1）和乙醇體積分數（X3）對黃酮提取率的影響均較大。由響應面的等高線圖2可知，料液比1 g∶20 mL～1 g∶30 mL、乙醇體積分數80%～90%的范圍內黃酮提取量較高。料液比（X1）和乙醇體積分數（X3）交互作用顯著，可能是因為料液比會影響溶質分子質量濃度，因而對金釵石斛黃酮的提取量產生交互影響。不同因素對金釵石斛黃酮提取量的影響非簡單的線性關系。

由回歸方程優化得出因素水平的最優組合，并將各因素水平轉換為實際值，得到金釵石斛黃酮提取的最佳工藝參數為：料液比1 g∶15.43 mL、提取溫度75℃，乙醇體積分數為89.96%?？紤]到實際操作可行性，將最佳提取工藝優化為：料液比1 g∶15 mL，提取溫度75℃，乙醇體積分數為90%。

2.2.4 驗證試驗 根據修正的最佳工藝條件，進行6次重復試驗，測得金釵石斛中總黃酮的提取量為0.551 5 mg/g（RSD＝1.24%，n＝6），與預測的黃酮提取量0.551 4 mg/g較為接近，表明運用響應面法設計優化得到的模型參數準確可靠。

2.3 抗氧化性試驗

2.3.1 ABTS自由基清除活性 將維生素C標準品配制成濃度為3 000.00、1 500.00、750.00、375.00、187.50、93.75、46.875μg/mL的樣品液。分別取維生素C及各樣品液0.1 mL，加入1 mL ABTS溶液，充分混合，室溫避光放置20 min，用紫外分光光度計在734 nm處測定吸光度。超純水為空白對照用，重復3次［15-16］。按下式計算清除率：

表3 回歸模型的方差分析

樣品和維生素C對ABTS自由基的清除能力見圖3-A，結果表明，樣品對ABTS自由基的清除能力呈現一定的濃度依賴性，當濃度達到1 500μg/mL的時候，金釵石斛黃酮對ABTS自由基的清除能力接近于維生素C，在更高濃度時（2 000～3 500μg/mL），其清除能力達100%。表明金釵石斛黃酮對ABTS自由基有良好的清除能力。通過SPSS軟件計算維生素C 和金釵石斛的IC50值分別為343.56、684.89μg/mL，表明金釵石斛黃酮對ABTS自由基的清除能力仍低于維生素C。

2.3.2 DPPH自由基清除活性 將維生素C標準品及金釵石斛黃酮提取液配制成濃度為3 000.00、1 500.00、750.00、375.00、187.50、93.75、46.875μg/mL的樣品液。分別取維生素C及各樣品液0.3 mL，加入0.9 mL DPPH甲醇溶液（0.1 mmol/L），室溫暗反應30 min，用紫外分光光度計在517 nm處測定吸光度［17-18］?？瞻讓φ沼贸兯鏄悠芬?，重復3次。按下式計算：

樣品和維生素C對DPPH自由基的清除能力見圖3-B，結果表明，樣品對DPPH自由基的清除能力與其濃度呈正相關，在0～750μg/mL濃度范圍內，隨著黃酮濃度的增加，對DPPH自由基的清除能力顯著增強。當濃度達到1 000μg/mL時，金釵石斛黃酮對DPPH自由基的清除能力接近最大值，約90%。表明金釵石斛黃酮對DPPH自由基有良好的清除能力。但通過SPSS軟件計算維生素C和金釵石斛的IC50值分別為139.23、425.34μg/mL，表明金釵石斛黃酮對DPPH自由基的清除能力仍低于維生素C。

2.3.3 清除羥自由基活性 將維生素C標準品及金釵石斛黃酮提取物配制成濃度為3 000.00、1 500.00、750.00、375.00、187.50、93.75、46.875μg/mL的樣品液。采用羥自由基試劑盒檢測，用紫外分光光度計在550 nm處測定吸光度?？瞻讓φ沼贸兯鏄悠芬?，重復3次。計算清除率：

樣品和維生素C對羥自由基的清除能力如圖3-C，結果表明，維生素C對羥自由基有很好的清除能力，且與其濃度呈正相關，隨著維生素C濃度的增加，對羥自由基的清除能力顯著增強。金釵石斛黃酮對羥自由基的清除能力也呈現一定程度的濃度依賴性，但其羥自由基清除能力低于陽性對照的維生素C，在高濃度4 000μg/mL時，其清除率為51.8%，表明金釵石斛黃酮具有一定的清除能力。通過SPSS軟件計算維生素 C 和金釵石斛的 IC50值分別為438.46、1 046.43μg/mL，表明金釵石斛黃酮對羥自由基的清除能力較對ABTS和DPPH這2種自由基的清除能力弱。

2.4 金釵石斛黃酮對間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）的保護作用

將第3代的MSC細胞接種96孔板，細胞濃度為1.5×105mL，每孔加入100μL細胞液，邊緣孔加無均水保濕，5%CO2培養箱中培養24 h，換液，每孔加入含不同濃度藥物（10、20、40、80、160、320μg/mL）的完全培養液100μL，每濃度設置5個復孔，空白組和H2O2組加入100μL完全培養液，培養箱繼續培養24 h，避光條件，每孔加入6 mmol/L H2O210μL，空白組不加H2O2，培養2 h后取出，每孔加20μL細胞計數試劑盒-8（CCK-8），繼續培養2 h，與490 nm處酶標儀測定各孔吸光度。試驗結果表明，在H2O2能夠明顯引起MSC的傷，與空白組相比具有顯著差異（P＜0.001）。與H2O2比較，除10μg/mL濃度組外，金釵石斛黃酮均能不同程度地保護MSC免受H2O2的損傷，黃酮濃度20μg/mL時開始有保護作用，到80μg/mL時保護作用最強，活性達到正常細胞的80%，損傷保護作用結果見圖4。

3 討論與結論

采用響應面法對金釵石斛黃酮的提取條件進行優化，建立了黃酮提取量的回歸模型，由該模型優化的黃酮提取條件為提取時間10min、料液比1 g∶15 mL，提取溫度75℃，乙醇體積分數為90%。根據修正的最佳工藝條件，進行6次重復試驗，測得黃酮提取量的均值為（0.551 5±0.000 4）mg/g，與模型預測值相符，進一步驗證了該模型的可靠性。抗氧化活性試驗表明，金釵石斛黃酮對ABTS自由基、DPPH自由基的清除作用明顯，對羥自由基有一定的清除能力。金釵石斛黃酮清除ABTS自由基、DPPH 自由基的IC50值分別為684.89、425.34μg/mL，說明金釵石斛黃酮具有較好的抗氧化活性，在天然抗氧化劑等領域具有較好的開發潛力。