薺菜TPD1基因啟動子與GUS基因表達載體的構建及擬南芥遺傳轉化

何金花，楊正修，姜路華，方 磊，趙 燕

（湖南農業大學生物科學技術學院，湖南長沙 410128）

植物花器官發育是植物生長周期的重要過程，也是發育生物學研究引人注目的事件。從最早提出的花器官發育ABC模型，逐步擴展到ABCD模型、ABCDE模型。目前，關于花器官的發生和發育相關的基因調控網絡已經積累了大量的信息，發現并克隆了一系列有關控制花器官分化和發育的基因。如控制擬南芥中花瓣、雄蕊、心皮、胚珠發育所必需的STK、SHP、SEP、AP1、AP3、AG、P1、LFY等基因［1-5］。其中與雌蕊發育相關的基因包括 AGAMOUS（AG）、CRABSCLAW（CRC）、SEUSS（SEU）、SPATULA（SPT）、STYLISH1（STY1）等［6］。擬南芥心皮發育主要受CRC、SPT、AG基因的控制，這3個基因相互關聯并發生作用［7］，三者屬于MADS-box［8-9］中的成員。Yang等在研究花粉不育的過程中克隆了擬南芥TAPETUM DETERMINANT（TPD1）基因，TPD1編碼1個含176個氨基酸的小蛋白與EMS1基因編碼的1個LRR-RLK（富亮氨酸）蛋白受體激酶［10-11］共同作用，參與花粉形成的調控機制［12］，TPD1主要是在小孢子母細胞中表達，其突變體tpd1在花藥細胞層出現發育缺陷，突變體的絨氈層細胞被額外形成的小孢子母細胞所取代。Yang等通過進一步研究，構建了35S：：TPD1過表達載體在擬南芥的心皮中進行異位表達，結果顯示，擬南芥長果角的心皮形態變寬變短了［13］。Huang等證實了AtTPD1基因在胚珠中的表達［14］，AtTPD1的異位表達可引起胚珠和種子發育中的多效缺陷，如改變胚珠發育期間生長素信號基因和核心細胞周期基因的表達，使細胞周期蛋白基因CYCD3和CYCA2在胚珠中的表達水平增高，一旦CYCD3表達模式受到影響，細胞周期則會發生紊亂，致使心皮細胞橫向分裂能力增強最終導致心皮變寬［15］。

擬南芥和薺菜同為十字花科植物，二者在遺傳背景、生理特性上有著較多的相似性，但其心皮形態差異顯著，擬南芥為二心皮發育成的柱形長角果，而薺菜則為二心皮心型短角果，說明兩者的同源基因在表達部位和表達模式上存在差異。為探討薺菜CbTPD1基因在心皮形態建成中的作用，本研究構建TPD1基因啟動子的GUS融合表達載體，轉化擬南芥，以期為探討TPD1基因在擬南芥和薺菜雌蕊（心皮）形態建成過程中表達模式的差異提供重要的生物學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

擬南芥（Arabidopsis thaliana）為Columbia生態型，薺菜（Capsella bursa-pastori）為野生型，均采集于湖南農業大學耘園實習基地；根癌農桿菌（Agrobacterium tumefactions）GV3101、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、載 體pCAMBIA1301均由湖南農業大學生物科學技術學院細胞生物學研究室提供。

1.2 植物培養條件

用0.1%氯化汞對擬南芥種子進行表面消毒8 min，于超凈工作臺上用無菌水漂洗8～10次，以適當密度播種于含10%蔗糖的1/2MS固體培養基上，避光，在4℃條件下春化3 d，轉入光照培養室（光周期晝/夜為16 h/8 h，22℃恒溫，50%恒濕）培養。待其長至14 d時，轉入盛有浸透營養液的人工土壤（腐殖土、蛭石、珍珠巖體積比為3∶1∶1）中，蓋上透明塑料薄膜培養2 d，生長條件同上。

1.3 pCA1301-CbTPD1pro::GUSWTBZ表達載體的構建及遺傳轉化

1.3.1 CbTPD1基因啟動子片段的克隆 根據GenBank公布的紅花薺菜TPD1基因序列推導出上游啟動子區域序列，利用DNAUSERchs軟件，分析CbTPD1pro啟動子序列的酶切位點。采用DNAMAN設計擴增引物CbTPD1pro-UP和CbTPD1pro-DN，在引物的5′端分別引入SmaⅠ和NcoⅠ酶切位點，CbTPD1pro-UP：TCCCCCGGGCTCGTGTGATTCTGATTAC TCTCT；CbTDP1pro-DN：CATGCCATGGGTGGTTAGACGTCGGG AAACT，以薺菜總DNA為模板進行PCR（預變性95℃，7 min；變性94℃，40 s；退火68℃，40 s；延伸72℃，100 s；終末延伸72℃，7 min；共30個循環）擴增，瓊脂糖凝膠電泳后回收純化目的片段。

1.3.2 pCA1301-CbTPD1pro：：GUS載體構建及工程農桿菌的制備 用SmaⅠ和NcoⅠ限制性內切酶在37℃條件下過夜雙酶切pCAMBIA1301載體和目的片段，將得到的目的片段和目的載體進行回收。用T4連接酶將CbTPD1基因啟動子連接至pCAMBIA1301載體的預期位點。通過熱激法將重組載體轉化至大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆進行菌落PCR鑒定并送華大基因測序以證實重組質粒的正確性，并將測序得到的薺菜CbTPD1基因啟動子序列與擬南芥AtTPD1基因啟動子進行元件的對比分析。

挑選測序正確的重組質粒通過電擊法轉化根癌農桿菌GV3101，將轉化液置于YEB固體培養基（內含50 mg/mL利福 平+50 mg/mL慶大霉素+50 mg/mL卡那霉素）上，28℃黑暗過夜培養，挑取陽性克隆進行菌落PCR鑒定并進行擴大培養，用于植物的轉化。

1.4 擬南芥的遺傳轉化及轉基因植株的鑒定

采用浸花序法轉化Columbia生態型擬南芥。收獲T0代種子播種于含潮霉素（30 mg/L）的1/2MS固體培養基上，在植物生長室培養2周左右將抗性植株移栽至人工土壤中正常生長，為檢測目的片段是否已經整合到轉化受體的基因組中，當植株長至6～8葉時，以CTAB法提取抗性植株葉片的DNA為模板，設計GUS基因特異性引物PC-TPD1proUP-CTCGT GTGATTCTGATTACTCTCTPC-GUSDn-CGAAACGCAGCACGA TACGC對轉基因植株進行PCR檢測，以Columbia生態型擬南芥為對照，鑒定轉基因植株。

1.5 轉基因植株的GUS組織化學染色及顯微觀察

取擬南芥轉基因植株的幼苗及花序等置于GUS染液中進行抽真空，直至材料組織沉入染液底部。置于37℃恒溫箱避光染色12 h左右，脫色后將染色組織置于奧林巴斯SZX10體式顯微鏡下觀察染色結果并拍照。

2 結果與分析

2.1 CbTPD1啟動子的克隆

根據GenBank公布的紅花薺菜TPD1基因序列推導出上游啟動子區域序列，設計擴增引物，以薺菜總DNA為PCR模板進行同源克隆，擴增出與預期大小1 561 bp相符的目的片段（圖1），經測序比對與預期一致，說明成功克隆了薺菜CbTPD1pro的啟動子序列。

2.2 pCA1301-CbTPD1pro::GUS載體的構建

對克隆至T載體上的CbTPD1pro片段的重組質粒pMD18-CbTPD1pro和植物表達Ti質粒載體pCAMBIA1301用SmaⅠ和NcoⅠ分別進行雙酶切，純化酶切產物，進行連接反應，構建pCA1301-CbTPD1pro：：GUS融合表達載體（圖2）。將連接產物熱激轉化到大腸桿菌，然后從大腸桿菌中DH5α提取該重組載體，再轉化到農桿菌感受態GV3101中，GV3101菌落PCR檢測（圖3）和酶切鑒定（圖4），與預期的CbTPD1pro 1 600 bp左右大小相符，說明 pCA1301-CbTPD1pro：：GUS報告載體構建成功。

2.3 CbTPD1基因啟動子測序與啟動子元件分析

通過PlantCARE啟動子在線分析軟件，對薺菜CbTPD1（圖5）、擬南芥AtTPD1基因啟動子元件的比較分析（表1）發現，二者均具有植物啟動子最基本的高轉錄水平調控因子、光響應元件、茉莉酸酯、赤霉素響應等元件。但二者的逆境脅迫響應元件存在較大差異，如CbTPD1pro缺乏水楊酸響應順式作用元件，赤霉素與茉莉酸酯響應元件也與AtTPD1pro有差異，CbTPD1pro元件中包含了參與玉米素代謝途徑，以及在胚乳表達的順式作用元件，而AtTPD1pro元件中卻沒有。其主要差異體現在胚乳表達元件、光響應元件以及對赤霉素、水楊酸的響應等方面。

2.4 擬南芥遺傳轉化及篩選

將成功轉入農桿菌的重組載體，通過浸花法轉化Columbia生態型擬南芥。收獲T0代種子平鋪于篩選培養基（1/2 MS+3%蔗糖+7%瓊脂+30 mg/mL潮霉素）上，7 d左右種子均可萌發。在植物生長室培養2周后可觀察到，非轉基因的擬南芥幼苗中由于沒有潮霉素抗性基因的表達，其根與真葉的分化受到抑制，葉片卷曲、植株無根，而后慢慢黃化萎蔫；成功轉入重組載體的擬南芥幼苗則正常生根，分化真葉，可以長出蓮座葉（圖6中黑色箭頭所示）。

2.5 轉基因植株的鑒定

將抗性苗移栽至營養缽，待生長健壯后取單株葉片提取DNA作模板，用檢測引物PC-TPD1proUP/PC-GUSDn進行PCR分子檢測。由圖7可知，1號泳道為野生型陰性對照，2號泳道為質粒陽性對照，3～12號泳道為轉基因陽性植株的分子檢測，其中除4號、8號、12號泳道檢測未獲得目的條帶，其余均可擴增出預期大小為1 561 bp的目的條帶，即為轉基因植株。PCR擴增結果表明，外源目的基因已整合進植株基因組中。

2.6 轉基因植株的GUS組織化學染色及顯微觀察

將轉基因擬南芥T1代種子平鋪于篩選培養基（1/2 MS+3%蔗糖+7%瓊脂+30 mg/mL潮霉素）上，置于光照培養室生長7 d后對幼苗進行GUS染色檢測，14 d左右移栽至營養缽繼續生長，對其花序進行GUS染色檢測，通過實體顯微鏡觀察。其染色結果（圖8、圖9）顯示，轉基因擬南芥幼苗中，薺菜CbTPD1pro：：GUS在幼苗期子葉、真葉、根、根毛等部位均可見明顯的GUS著色，表明薺菜CbTPD1啟動子驅動的GUS報告基因在擬南芥幼苗各部位均有高水平的表達（圖8-A、圖8-B為轉35S：：GUS陽性對照）。花序中花器的果莢柄、花絲、蜜腺、柱頭及花瓣的維管束等部位均檢測到明顯的GUS活性（圖8-E、圖8-F、圖8-G、圖8-H），但在花藥中卻沒有GUS活性的表達（圖8-F），這與實驗室前期AtTPD1在擬南芥花藥中的過表達結果不同，擬南芥AtTPD1在花藥中表達明顯（圖9-A、圖9-B）。從花器發育的幾個時期取材進行GUS染色的結果分析發現，CbTPD1pro：：GUS在花序幼嫩的花蕾期幾乎不表達（圖8-C、圖8-E）。當花器發育至第8至第9期左右時，CbTPD1基因可在雌蕊的柱頭表達，隨后開始在花托、花萼、蜜腺等部位表達，其中在第12、第13期左右其表達量達到峰值，在后續心皮發育過程中，心皮的頂部及基部始終具有較高水平的表達（圖8-C、圖8-E、圖8-F、圖8-G，圖8-D為野生型花序對照）。其GUS基因在薺菜花器官中的表達活性和組織定位，為后續研究CbTDP1基因在薺菜、擬南芥心皮發育過程中的不同表達模式提供了有價值的依據。

表1 薺菜與擬南芥TPD1啟動子元件分析比對

3 討論

本研究以pCAMBIA1301為出發質粒構建了薺菜CbTPD1基因啟動子的GUS融合表達載體，并通過轉化Columbia生態型擬南芥獲得了穩定遺傳的轉基因植株，為進一步研究CbTPD1基因的表達特征提供了可靠的材料。現有研究表明，AtTPD1在絨氈層發育時期主要是在生殖細胞中表達，它的突變影響絨氈層細胞的分化發育，使花藥細胞層出現發育缺陷，其絨氈層細胞被額外形成的小孢子母細胞所取代［16］，TPD1可通過與EMS1互作參與花粉形成的調控并可在心皮進行異位表達，參與心皮形態建成。有意思的是，本研究將薺菜CbTPD1啟動子驅動的GUS基因轉化擬南芥后發現，薺菜CbTPD1卻不在擬南芥的花藥（雄蕊）中表達，這與Yang等報道的擬南芥AtTPD1參與絨氈層的形成及小孢子母細胞的發育等研究結果［13］不同，這暗示了CbTDP1基因可能不參與絨氈層和小孢子母細胞的發育，而是特異性地在心皮中表達并影響和促進其最終發育成短角果，或在參與花粉發育調控網絡的位置上與擬南芥有所差異，TDP1基因在薺菜、擬南芥心皮發育過程中的不同表達模式，影響整個心皮發育的基因調控網絡而導致了兩者心皮形態的差異。但植物心皮形態發育過程受多種基因調控，這些基因協同參與心皮形態的建成，除主效基因直接參與調控心皮發育外，生長素的極性運輸和濃度分布都對雌蕊頂端發育及心皮的形態建成具有重要作用。本研究通過對薺菜CbTPD1啟動子在擬南芥中的GUS染色定位分析為深入研究該基因對心皮形態建成的影響奠定了研究基礎。