巨菌草內生固氮菌Klebsiella variicola GN02的毒理性與固氮能力

林標聲，陳 意，羅茂春，張浣星，林占熺

［1.龍巖學院生命科學學院，福建龍巖 364012；2.福建農林大學生命科學學院，福建福州 350002；3.國家菌草工程技術研究中心，福建福州 350002；4.奧蘭多（杭州）實業有限公司，浙江杭州310051］

Klebsiella variicola GN02是從巨菌草（Pennisetum sinense Roxb）成熟期根部分離得到的一株具有較高固氮酶活性［378.22 nmol/（mL·h），以C2H4還原量計］的內生固氮菌，前期試驗表明其具有良好的溶磷，產氨、產鐵載體，分泌抗生素等促生性能，是制備微生物復合菌肥的潛在良好菌株來源［1］。K.variicola GN02屬于腸桿菌科克雷伯氏菌屬菌株，而克雷伯氏菌屬的多類菌株是重要的條件致病菌和醫源性感染菌，因而人們對K.variicol在農業上的應用一直存在一定的疑慮［2］。多年來，農業微生物和工業污染治理等方面的研究表明，克雷伯氏菌對植物本身不表現致病性，而且還是一種有效的綠色菌肥和高效凈化劑［3］；但也有人認為與植物聯合固氮的K.variicola菌株和人源Klebsiella spp菌株之間的遺傳差異較小，都有K.pneumoniae的致病相關因子，因此將其制備成微生物菌肥在田間施用具有一定的風險［4］。因此，有必要對K.variicola GN02進行非致病性安全性鑒定，明確其是否安全、無毒。

植物內生固氮菌與植物在長期進化和系統發育過程中建立了一種聯合的關系［5］，大量研究表明，禾本科植物接種內生聯合固氮菌后能行固氮作用，但由于固氮菌株、植物類型、生長環境等條件的不同，其固氮量存在較大的差異（4.5%～21.2%）［6］。15N同位素稀釋法能準確區分和測定植物不同生長時期、不同來源的氮源，成為了植物內生固氮菌固氮量測定的、較為準確和常用的方法［7］，目前在許多豆科植物和禾本科植物中都有應用［8-9］，但尚未發現其在巨菌草中固氮菌的研究中應用。

因此，本研究以GB 15670—1995《農藥登記毒理學試驗方法》為依據［10］，對K.variicola GN02進行系統的毒理性試驗研究，并以K.pneumoniae不同血清型特異性靶基因序列設計相應引物，對K.variicola GN02進行血清型分型，進一步明確其和臨床上傳染性K.pneumoniae之間的聯系。此外，本研究還采用了15N同位素稀釋法評價GN02菌株在巨菌草不同生長時期根莖葉中的固氮效率，以期為生產上以GN02菌株制備微生物固氮菌肥，并在巨菌草及其他禾本科植物中的實際應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株、培養基及供試動物

K.variicola GN02：由筆者所在實驗室從巨菌草成熟期根部分離，并經16SRNA和促生性能鑒定后在中國普通微生物菌種保藏管理中心保藏（CGMCC 1.13619）；肺炎克雷伯氏菌（K.pneumonia）購自杭州濱和微生物試劑有限公司，菌種保藏號CMCC46117；Ashby無氮培養基：甘露醇10 g/L，KH2PO40.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，NaCl 0.2 g/L，CaSO4·2H2O 0.1 g/L，CaCO35.0 g/L，pH值7.0～7.2；昆明小鼠，體質量18～20 g；Wistar成年大鼠，體質量200～300 g，均購自福建省閩侯縣吳氏實驗動物貿易有限公司；供試菌液為1.5×108CFU/g GN02菌株培養液（或對數生長期培養16～20 h）。

1.2 主要試劑和儀器

15NH4Cl，豐度30.15%，上海化工研究院合成；DNA marker，各限制性內切酶購自天根生化科技（北京）有限公司。

石蠟切片機，萊卡RM2016，徠卡顯微系統（上海）貿易有限公司；研究型正置顯微鏡，尼康DS-Fi2，尼康儀器（上海）有限公司；PCR儀，ABI-2720，美國Applied Biosystems公司；電泳儀，Mini Pro 300V Power Supply，賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 K.variicola GN02急性毒性試驗

1.3.1 小鼠急性經口毒性試驗 按最大限量法選擇健康昆明小鼠40只，雌雄各半，平均分成對照組和試驗組。試驗組將準備好的GN02菌株供試菌液按0.1 mL/10 g經口灌胃給予小鼠（對照組用同等濃度生理鹽水灌胃），灌胃前動物隔夜禁食、自由飲水。灌胃后給予正常飲食，觀察14 d，記錄小鼠中毒體征及死亡情況，按GB 15670—1995《農藥登記毒理學試驗方法標準》中所列參考依據評定GN02菌株毒性。同時，將兩組小鼠隨機抽取3只分別進行呼吸道解剖和肺部的石蠟切片觀察，進一步確定2組小鼠接種GN02菌株的病理變化情況。

1.3.2 大鼠急性經皮毒性試驗 按最大限量法，選擇Wistar成年大鼠20只，雌雄各半，平均分成對照組和試驗組。先將2組大鼠分別北部剃毛，面積20 cm2（4 cm×5 cm）。試驗組在略小于剃毛面積內用滅菌棉簽涂抹GN02菌液（0.1 mL/10 g BW 用量），對照組用同等濃度生理鹽水敷藥，后用保鮮膜覆蓋剃毛區域，并用膠布固定，防止大鼠舔食菌液，涂藥時間持續4 h，其間觀察并記錄2組大鼠是否有中毒現象。涂藥結束后，用溫水徹底清洗大鼠涂抹皮膚上的菌液，再繼續觀察14 d，再次觀察和記錄2組大鼠的中毒體征及死亡情況。按上述的國家標準判斷GN02菌株毒性，同樣對2組大鼠進行呼吸道解剖和肺部石蠟切片觀察，進一步確定2組大鼠接種GN02菌株的病理變化情況。

1.4 GN02菌株血清型檢測

GN02菌株DNA的提取采用細菌基因組提取試劑盒［天根生物化科技（北京）有限公司］，采用PCR擴增相關基因，以固氮菌特異性基因NifH和肺炎克雷伯氏菌臨床上最為流行的7種分型（K1、K2、K3、K5、K20、K54和K57）設計特異性引物進行鑒定。7種分型的引物序列參考相關文獻，由上海鉑尚生物技術有限公司合成；NifH 特異性引物為：引物F，5′-AATGACCATGCGTCAATGC-3′；引物R，5′-GTGAGGATC CTGTGCTCAG-3′。將提取DNA統一濃度為100 ng/μL作為PCR反應體系模板，以無菌去離子水作為陰性對照；同時提取臨床上常見的K.pneumoniae CMCC46117基因組DNA，同樣以7種分型特異性引物進行鑒定作為對比。PCR反應體系（25μL）：DNA模板0.5μL，H2O 7.5μL，引物F（10μmol/L）1μL，引物R（10μmol/L）1μL，2×Taq PCR Master Mix 10μL；PCR反應條件：94℃4 min；94℃45 s，58℃45 s，72℃90 s，30個循環；72℃2 min。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。

1.5 K.variicola GN02對巨菌草生物固氮的影響

1.5.1 采用15N同位素稀釋法 將溫室中培養好的巨菌草小苗（5～10 cm）從秧苗培育盤中取出，將根部清洗干凈，在超凈臺上將苗用2%次氯酸鈉表面消毒5～10 min，再用無菌水清洗，用滅菌小刀輕劃根系，再浸入對數生長期的GN02菌株培育菌液中30 min，同時以無菌水蒸餾水浸泡為對照。

將試驗用土過篩、高壓滅菌后分裝于16.5 cm×11 cm的塑料盆（購自鑫騰花卉專營店，江蘇宿遷），每盆施入1.5 g15NH4Cl，對照組和試驗組各栽11盆，共22盆，每盆栽巨菌草苗各3～5株。用無菌水配制無氮培養基營養液，每隔5 d澆無菌水600～800 mL/桶，每隔10 d澆此營養液600～800 mL/桶，直至試驗結束。

1.5.2 固氮量和固氮率的測定 分別在巨菌草生長的苗期、分蘗期、拔節期和成熟期4個時期，將塑料桶剪開，除去植株根部泥土、洗凈，每時期取樣3桶，包括根、莖和葉，剪碎、混勻，60～70℃烘干，各樣品分別取1 g送至上海化工研究院測定全氮含量和15N原子百分超。按下列公式計算植株的固氮量和固氮率，并對所得數據進行統計學差異分析（SPSS 17.0軟件）。

2 結果與分析

2.1 GN02菌株急性毒性試驗

小鼠急性經口毒性試驗和大鼠急性經皮毒性試驗表明，小鼠灌胃和大鼠經皮涂菌后，動物均未發現明顯的中毒現象，連續觀察14 d，也均未發現動物死亡現象（表1），試驗結束后，動物解剖也未發現異常，動物呼吸道（特別是肺部）沒有發現明顯的病變（圖1）；與對照組相比，試驗組的肺部石蠟切片不同部位的對比觀察也未發現明顯的異常（圖2）。按GB 15670—1995《農藥登記毒理學試驗方法標準》中所列參考依據評定GN02菌株毒性為微毒以下，無明顯毒性，可在農業生產上應用。

表1 GN02菌株急性毒性試驗結果

2.2 GN02菌株血清分型的結果

以肺炎克雷伯氏菌臨床上最為流行的7種分型引物對GN02菌株進行鑒定，結果如圖3所示，以GN02-DNA為模板，NifH引物擴增為陽性；分別以H2O、GN02-DNA為模板，7種分型引物擴增均為陰性；以K.pneumoniae CMCC46117-DNA為模板，7種分型引物擴增鑒定為K2分型。該研究結果表明，GN02菌株具有固氮菌特異性基因NifH，但不屬于7種臨床上流行的肺炎克雷伯氏菌分型，不是流行的肺炎克雷伯氏菌強毒力菌株，不會引起嚴重的臨床疾病。

2.3 GN02菌株對巨菌草生物固氮的影響結果

將GN02菌株接種于巨菌草，其不同生長時期根莖葉的固氮率和固氮量見表2。結果表明，GN02菌株在不同生長時期巨菌草根莖葉中均具有一定的固氮能力；根、莖、葉固氮率和固氮量均為成熟期＞拔節期＞分蘗期＞苗期，各成熟期固氮率可達15%～27.27%，與其他禾本科植物所報道的固氮菌固氮效率基本相當［11-12］，且各成熟期固氮率和固氮量與其他時期相比均達到了顯著差異（P＜0.05），表明隨著種植時間的延長，GN02固氮菌株數量逐漸增加，固氮效率也逐漸提高；而在同一生長時期，不同部位的固氮率和固氮量均表現為葉＞根＞莖，且各生長時期葉的固氮率和固氮量與根、莖相比差異葉均達到了顯著水平（P＜0.05）。

3 小結

近年來，許多學者都報道了K.variicola能夠在甘蔗［13］、石斛［3］、香蕉［4］等植物內部定殖，并具有良好的固氮促生性能，但同時人們對K.variicola對動物和植物的潛在致病性一直存在擔憂，對其在農業上的應用持謹慎態度。

本試驗研究了一株從巨菌草中分離的內生固氮菌Klebsiella variicola GN02的毒理性固氮能力，結果表明，GN02菌株無明顯的經口毒性和經皮毒性，不是臨床上流行肺炎克雷伯氏菌已有分型的強毒力菌株；GN02菌株在不同生長時期巨菌草根莖葉中均具有一定的固氮能力，不同生長時期其固氮率和固氮量均為成熟期＞拔節期＞分蘗期＞苗期，在同一生長時期其固氮率和固氮量均為葉＞根＞莖；根莖葉各成熟期固氮百分率可達15%～27.27%，與其他禾本科植物所報道的固氮菌固氮效率基本相當。表明GN02菌株安全、無毒，具有一定的固氮能力，可在農業生產中使用，并為將來以其為菌株資源制備固氮菌肥、挖掘應用潛能、在綠色農業可持續發展中發揮重要作用奠定理論基礎［14］。

表2 不同生長時期巨菌草根、莖、葉的固氮率和固氮量