明悉引物設計 參透PCR技術

孫 娟

(首都師范大學附屬回龍觀育新學校 北京 102208)

關鍵字 PCR 引物設計 題型解析

PCR(Polymerase Chain Reaction)是一種人工合成DNA的聚合酶鏈式反應，PCR技術是高中生物學選修3《現代生物科技專題》模塊的重點和難點之一，其基本原理和過程如圖1所示。

圖1 PCR原理反應示意圖[1]

在教學實踐中，教師一般采用動畫演示或者繪圖的方式闡釋PCR的原理和過程。但是，學生在解決PCR實際問題時仍然會有很多困惑，其中最為突出的問題是PCR的引物設計。引物設計是PCR的核心，學生既可以通過Primer Premier等軟件去設計引物，也可以通過考題去明悉引物設計的意義，從而深刻理解PCR的原理和過程。

PCR除了能完成常規的DNA擴增，還可以通過巧妙的引物設計實現基因定點突變、添加酶切位點、特定片段的拼接(搭橋PCR)等功能。本文結合具體題目明悉引物設計的多種方法，從而對不同的PCR進行深度解析。

1 常規PCR的引物設計和選擇

PCR的引物包括兩條，這兩條引物能夠分別與待擴增片段(序列已知)的兩條鏈堿基互補配對，而DNA的兩條新鏈延伸方向相反，這與DNA的空間結構為反向平行雙螺旋的特點是一致的。在常規的引物設計中，均應包括兩條引物，且位于待擴增片段的兩端，引物方向均為5′→3′。擴增目的不同，選擇的引物也會不同，但基本原則相同。

例1 (2014年·北京30題)(2)a基因是通過將T-DNA插入到A基因中獲得的，用PCR法確定T-DNA插入位置時，應從圖2中選擇的引物組合是。(參考答案： II、 III)

圖2 鏈式DNA引物選擇題型注： Ⅰ、 Ⅱ、 Ⅲ為引物

解析： 此題目中PCR是為了確認插入位置，故需要將T-DNA與A基因連接的位置擴增出來，引物應分別與上下兩條鏈互補，圖2給出了引物的方向(延伸方向為5′→3′)，所以，只能選擇II、 III。

例2 (2011年·北京31題)(6)根據T-DNA的已知序列，利用PCR技術可以擴增出被插入的基因片段。其過程是： 提取突變體植株的DNA，用限制酶處理后，再用將獲得的DNA片段連接成環(圖3)，以此為模板，從圖中A、 B、 C、 D四種單鏈DNA片斷中選取作為引物進行擴增，得到的片斷將用于獲取該基因的全序列信息。(參考答案： DNA連接酶；B、 C)

圖3 環狀DNA引物選擇題型注： A、 B、 C、 D表示能與相應T-DNA鏈互補、長度相等的單鏈DNA片段；箭頭指示DNA合成方向

解析： 此題通過PCR可以獲取未知基因的全部序列信息，因此，需要將“被插入的基因片段”全部擴增出來，引物應位于其兩端，且分別于兩條鏈互補。圖3給出了A的方向，根據DNA的結構特點可知，C與A方向相同，B、 D的方向與A相反，選用A、 D能夠擴增出T-DNA序列，選用B、 C才能擴增出包含“被插入的基因片段”的序列信息，故選擇B、 C。

例3 (北京·西城2017.1，26題)(2)②利用PCR技術從cDNA文庫中獲取AtNX1基因(基因序列未知)，需根據AtNX1蛋白氨基酸序列設計引物，引物的序列可以有多種，原因是。在PCR體系中需加入其中的引物(填“全部”或“任意1種”或“其中2種”)。(參考答案： 全部)

解析： 此題的難度較例1、2有所增加，考查了引物與模板堿基互補配對的特點，由于密碼子具有簡并性(一種氨基酸對應多種密碼子)，并不能確定哪一種引物可以和未知序列堿基互補配對，因此，需要將全部引物加入，配對成功的引物可以完成PCR擴增過程，其他引物因無法配對不形成干擾。

2 基因定點突變的引物設計

例4 (北京·海淀2017.11，34題)(2)蘿卜的蛋白A具有廣泛的抗植物病菌作用，而且對人體沒有影響。檢測發現，轉入的蛋白A基因在大腸桿菌細胞中表達效率很低，研究者推測不同生物對密碼子具有不同的偏好，因而設計了與蛋白A基因結合的兩對引物(引物B和C中都替換了一個堿基)，并按圖4方式依次進行4次PCR擴增，以得到新的蛋白A基因。①這是一種定點的技術。②圖4所示的4次PCR應該分別如何選擇圖中所示的引物？請填寫以下表格(若選用該引物劃“√”，若不選用該引物則劃“×”)。(參考答案： (2)① 基因突變 ② 如下表所示)

引物A引物B引物C引物DPCR1√√××PCR2××√√PCR3××××PCR4√××√

解析： 此題的引物設計與以往都不同，B和C中都替換了一個堿基，從圖4分析可知，這兩個引物位于基因的相同位置，替換的堿基應該能夠互補配對，如此便可以實現將基因A的特定位置替換為新的堿基對。因此，屬于一種基因突變的技術。后續的PCR過程就是為了完成基因的定點突變，根據引物設計原則，學生可以從PCR1、 PCR2的圖示中選出引物A&B、 C&D。

PCR1、 PCR2的產物混合后退火，由圖4可見，引物B、C所在位置的序列可以堿基互補配對結合在一起，從而使蛋白A基因的兩條鏈以局部配對的方式結合，并彼此充當引物(不需要額外添加引物)，完成5′→3′方向的延伸過程。因此，PCR3的結果是在替換了一個堿基的位置發生基因的定點突變。PCR4過程是為了獲取更多新的蛋白A基因，選取的引物應位于其兩端，根據擴增方向為5′→3′的原則，選擇的引物應該是A和D。

圖4 基因定點突變原理示意圖 注： 圖中“”為堿基序列變化點

此題進行PCR擴增的目標是實現某一個特定位置堿基對的替換，因此，需要根據目的基因的序列進行分段PCR，最后再將兩段拼接起來，是一種比較傳統和實用的體外基因突變方法。隨著科技的發展，CRISPR-Cas9定點突變技術應用更為廣泛，其原理見例5。

例5 (北京·海淀2016.5)敲除基因時，sgRNA與紅眼基因B的部分序列互補配對，細胞內的Cas9酶在配對區域定點剪切，引起紅眼基因B發生堿基對，導致基因突變。該過程中，sgRNA和Cas9酶共同剪切DNA的作用類似于酶的作用，敲除后需要酶對DNA上的切口進行修復。(參考答案： 缺失，限制，DNA連接)

圖5 CRISPR-Cas9技術原理圖

解析： 此題中，基因突變是通過sgRNA(small guide RNA，向導序列)實現的，sgRNA是人工設計的能夠與特定基因堿基互補配對的一小段RNA，當其與目的基因結合后，Cas9酶就可以對目的基因進行剪切，從而實現基因突變。

3 搭橋PCR與酶切位點的添加

例6 (北京·海淀2017.5，30題)(3)為研究基因A與四膜蟲的耐藥性是否有關，科研人員提取耐藥個體的DNA，用圖6所示的引物組合，分別擴增A基因的A1片段、A3片段。

圖6 添加特定序列的PCR引物選擇注： 引物Ⅱ、 Ⅲ上的x、 y片段分別與N基因兩端互補配對

① 據圖6分析，用引物Ⅰ、 Ⅱ組合擴增后，得到的絕大部分DNA片段是下圖中的。

② 將大量N基因片段與擴增得到的A1片段、A3片段置于PCR反應體系中進行擴增，得到的絕大多數擴增產物是。(參考答案： (3)①d ②A1-N-A3)

解析： 此題的難點在于對PCR過程的分析，引物與模板鏈結合后，在Taq酶的作用下開始延伸，延伸的終點為模板鏈的終點(圖7)，第二輪擴增后會出現“A1-x”序列，之后以2n擴增，同時，以“A1-A2-A3”為模板進行的擴增在兩輪后都會產生“A1+x”片段，最終反應體系中“A1-x”數量最多。同理，用III和IV擴增出的應為“y-A3”。

在N基因片段與擴增得到的A1片段、A3片段的PCR反應體系中，通過引物中x、 y片段局部配對的方式，兩條鏈可以結合并分別充當彼此的引物，不再需要額外添加引物，其原理與例4的PCR3過程(圖4)相同。最終，通過搭橋PCR的方式實現“A1-N-A3”的拼接。

圖7 添加特定序列的PCR原理

4 簡并引物與突變位點確認

例7 原創試題(節選)： 采用電擊轉化法將已知序列的外源DNA片段隨機插入野生型衣藻基因組中可獲得衣藻的鞭毛突變體，為進一步確定突變體衣藻的突變基因，設計以下實驗(圖8)。若要確定外源DNA片段插入X基因的位置，需要選用引物及，分別擴增出對應序列，再通過測序和序列比對確定外源DNA片段插入X基因的a和b兩個位置。(參考答案： 1、3；2、4)

圖8 確認突變位點的PCR引物選擇

解析： 此題需要找出外源DNA在A基因中的插入位點a、 b，因此，需要分別擴增出包含a、 b兩個位點的序列，按照圖示應選擇1、3擴增出左側片段，選擇2、4擴增出右側片段，測序后即可得知插入位點的序列。

此項PCR技術中的X基因序列是未知的，因此，并不能設計出與其堿基互補配對的引物3、4。在實際操作中，通常會通過查詢衣藻的全基因組序列找出其較為保守的一些序列，從而設計出一些能夠與多個位點結合的簡并引物(degenerated primers)，在PCR過程中，同時加入簡并引物3、4和1、2(與已知序列結合)，通過調整退火溫度，促使3、4引物與多個位點發生特異或非特異結合，其中有一部分即為包含a或者b的產物。之后，通過瓊脂糖凝膠電泳技術，使不同長度的PCR產物分離開，選擇含量較高的(條帶較寬)的位置切下膠塊進行DNA回收，測序后通過與外源DNA序列比對得出a、 b所在具體位點。