基于TCGA數據集分析線粒體轉錄終止因子2基因在宮頸癌的表達及意義＊

普元倩，梅 雯，王唯斯，李 彬，張 態，張若鵬，熊 偉

宮頸癌是全球婦女中僅次于乳腺癌的第二個最常見的惡性腫瘤。在我國，宮頸癌的每年新發病例為13.2萬，約占世界新發病例的28.8%［1］。宮頸癌病死率居女性惡性腫瘤病死率的第二位，在女性生殖器官腫瘤中居首位［2］。腫瘤的生物學特性不僅取決于核內遺傳物質，而且與核外的線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）也有一定的關系［3］。線粒體轉錄終止因子 （mitochondrial transcription termination factor，MTERF）是一類由核基因編碼通過特殊的方式轉運到線粒體，并能與mtDNA特異結合的蛋白質，在mtDNA的復制、轉錄以及翻譯中發揮調控作用［4］。線粒體轉錄終止因子蛋白家族有4個成員（MTERF1~F4），其中線粒體轉錄終止因子2 （mitochondrial transcription termination factor 2，MTERF2）又稱線粒體轉錄終止因子D3（mitochondrial transcription termination domain containing 3，MTERFD3）或線粒體轉錄終止樣因子（mitochondrial transcription termination-like factor，MTERFL）［5］。MTERF2基因是通過比較正常血清培養與血清饑餓培養的人成纖維細胞基因表達譜差異發現的一個細胞增殖抑制基因［6］。人MTERF2基因定位于12q23.3，可編碼由385個氨基酸殘基構成的蛋白質，定位于線粒體內［7］。研究表明，人MTERF2蛋白在體內與mtDNA的結合沒有序列特異性，且抑制線粒體基因的表達［8-11］。MTERF2蛋白在線粒體內的含量相對豐富，是線粒體擬核的重要組成成分［12］。目前，對于MTERF2基因在宮頸癌發生發展的作用及其機制尚不清楚，該研究旨在利用TCGA數據集分析MTERF2在宮頸癌中的表達及其預后意義。

1 材料與方法

1.1 數據集下載 利用R3.3.3軟件Bioconductor/TCGA Biolinks函數包從 TCGA 數據庫（https：//tcga-data.nci.nih.gov/tcga/）下載并預處理宮頸癌數據集的MTERF2 mRNA表達RNA SeqV2數據。

1.2 GEPIA數據庫分析TCGA數據集中宮頸癌和正常宮頸組織MTERF2表達差異 基因表達譜動態分析 （Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）（http：//gepia.cancer-pku.cn/） 是由北京大學研制開發可用于分析基因在癌癥和正常組織的差異表達的在線應用，可對TCGA數據庫進行可視化分析。TCGA宮頸癌數據集中包括306例宮頸癌組織樣本和13例正常宮頸組織樣本，用GEPIA分析MTERF2在宮頸癌和正常宮頸組織中的表達差異。

1.3 數據集篩選與宮頸癌臨床病理學參數資料相關研究 TCGA數據庫中下載得到含有人MTERF2 mRNA表達量的宮頸癌組織樣本306例，剔除臨床病理參數不詳或不完整的病例以及重復的資料病例，僅保留TCGA數據集中包含完整臨床參數和生存資料的病例，最后得到含有完整臨床病理參數和生存資料的病例246例。按病例的ID號將患者的臨床資料與MTERF2 mRNA表達RNA SeqV2數據合并成同一個Excel表格。根據 表達譜數據，對宮頸癌組織樣本的MTERF2表達量進行由低到高排序，樣本中MTERF2表達量為62.420~911.306，中位數為212.666。將數據進行二等分，低于中位數的樣本為低表達組，高于中位數的樣本為高表達組。獲取的TCGA數據集宮頸癌患者MTERF2低表達組123例，高表達組123例。

1.4 統計學方法建立患者臨床資料庫，將患者年齡、腫瘤大小及浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移、AJCC臨床分期、病理分級、病理類型、MTERF2 mRNA表達水平等指標進行量化賦值后進行統計學分析，具體賦值見表1。使用R 3.3.0軟件進行統計學分析，采用Shapiro-wilk法檢測宮頸癌組織中MTERF2 mRNA表達量的數據正態分布情況，結果表明MTERF2 mRNA表達水平不符合正態分布，所以宮頸癌組織中MTERF2表達水平采用Mannwhitney U非參數檢驗。臨床病理參數相關性分析，組間比較采用χ2檢驗及Fisher確切概率法。使用R語言Survival軟件包以Kaplan-Meier法繪制生存曲線并進行Log-rank檢驗，多因素分析采用Cox回歸模型。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 宮頸癌與正常宮頸組織MTERF2表達差異使用GEPIA數據庫對TCGA數據集進行數據挖掘和可視化分析，結果發現，相較于正常宮頸組織，宮頸癌組織中MTERF2 mRNA表達水平顯著降低，且差異具有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 宮頸癌組織和正常宮頸癌組織中MTERF2 mRNA 表達差異（＊P＜0.05）

2.2 MTERF2表達與宮頸癌患者臨床病理學參數相關性 在TCGA數據集中共納入246例臨床病理參數完整的病例資料，年齡21~85歲，中位年齡46歲。對該數據集中宮頸癌患者預后影響因素進行賦值（表1），通過統計分析資料可知，宮頸癌患者MTERF2 mRNA表達量與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移、AJCC臨床分期和病理分級無關（P＞0.05）；與年齡（P=0.018）、病理類型（P＜0.001）明顯相關。見表2。

表1 宮頸癌患者預后影響因素及其賦值

圖2 人MTERF2 mRNA表達水平與宮頸癌患者預后的相關性

表 2MTERF2 mRNA表達水平與宮頸癌臨床病理參數的相關性分析（n=246）

2.3 MTERF2表達與宮頸癌患者預后的相關性使用R語言Survival軟件包對TCGA數據集中MTERF2高表達組和MTERF2低表達組宮頸癌患者的預后進行Kaplan-Meier分析和Log-rank檢驗，分別繪制總體生存率（overall survival，OS）和無疾病進展生存率（disease free survival，DFS）生存函數曲線（圖2）。結果表明，MTERF2 mRNA表達量與宮頸癌患者的OS和DFS均無明顯的相關性（Log-rank P＞0.05）。

2.4 影響宮頸癌患者預后的COX多因素回歸分析 單因素分析結果顯示，腫瘤浸潤程度、淋巴結轉移、遠處轉移、AJCC臨床分期均能影響患者的預后（P<0.05）。 年齡、病理分級、病理類型、MTERF2 mRNA表達量與宮頸癌患者預后無相關性 （P>0.05）。將單因素分析中對預后有影響的指標納入COX模型行多因素回歸分析，結果提示，淋巴結轉移是影響宮頸癌患者預后的獨立因素（P<0.05）。見表3。

3 討論

癌癥的發生不僅與核內遺傳物質相關，還與核外的mtDNA密切相關。由于mtDNA缺乏組蛋白的保護，無DNA修復系統，處在高氧化應激環境中，容易受電子傳遞鏈產生的自由基的損傷，與化學致癌物的親和力較核基因組高等原因，使mtDNA具有較高的突變率，可能具有潛在的致癌性［13］。研究發現，在多種癌組織及其相應的體液標本存在mtDNA的突變，如宮頸癌、卵巢癌、頭頸癌、膀胱癌和大腸癌等［14-17］。惡性腫瘤的發生不僅與mtDNA結構改變相關，還與其數量有密切聯系。與正常組織相比，不同類型的腫瘤組織中mtDNA數量有著不同程度的增多或者減少［18］。線粒體是細胞內重要的細胞器，線粒體功能障礙與惡性腫瘤、線粒體糖尿病、神經退行性疾病等疾病的發生密切相關［19］。研究表明，細胞內過表達MTERF2基因顯著抑制細胞生長和增殖的作用，細胞周期阻滯于G1/S期，但并不誘導細胞凋亡［6］。最近，Han等報道人MTERF2蛋白對1-甲基-4苯基吡啶離子 （1-methyl-4-phenyl-pyridiniuiodide，MPP+）誘導的神經細胞線粒體功能障礙和細胞損傷具有促進作用［20］。MTERF2是調控線粒體基因表達的重要蛋白因子，目前，MTERF2在腫瘤中的表達及其預后意義目前尚未見報道。

該研究中，筆者使用R語言軟件從TCGA數據庫下載306例宮頸癌組織和13例正常宮頸組織RNA SeqV2數據。GEPIA分析結果發現，相較于正常宮頸組織，宮頸癌組織中MTERF2 mRNA表達水平顯著降低，且差異具有統計學意義（P＜0.05），結果提示MTERF2基因在細胞內的功能可能類似于細胞抑癌基因。TCGA數據集處理后獲取246例宮頸癌患者MTERF2 mRNA表達量、臨床病理資料等完整的數據，根據MTERF2 mRNA的中位表達量，將研究對象分為MTERF2高表達及低表達兩組。分析發現，宮頸癌患者MTERF2 mRNA表達量與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移、AJCC臨床分期、病理分級均無關（P＞0.05）；而與年齡、病理類型相關（P＜0.05）。進一步Kaplan-Meier生存分析宮頸癌患者MTERF2表達量與預后的關系，結果提示MTERF2 mRNA高表達組與低表達組的總體生存率及無疾病進展生存率的差異無統計學意義 （P＞0.05）。單因素分析顯示，腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移、臨床分期均能影響患者的預后（P<0.05）。年齡、病理分級、病理類型、MTERF2 mRNA表達與宮頸癌患者預后無相關性（P>0.05）。COX多因素回歸分析結果提示，淋巴結轉移是影響宮頸癌患者預后的獨立因素（P<0.05）。

表3 影響宮頸癌患者預后的單因素和多因素回歸分析

該研究的優勢在于利用TCGA在線數據庫，樣本量較大，臨床資料完整。而不足之處在于，TCGA數據集中提供的是mRNA水平的表達數據，可能無法完全代表MTERF2在蛋白質水平的表達情況。在后續的研究中應該結合Western blot和免疫組織化學方法進一步分析討論。該研究為MTERF2在腫瘤中的基礎和臨床研究提供了線索和依據，需要進一步的研究更深入地探討MTERF2在腫瘤發生發展中的作用及機制，為腫瘤的靶向治療提供新思路。