組蛋白去乙酰化酶在口腔來源成體干細胞成骨向/成牙本向分化的研究進展

宋 詞，陳 婷，吳補領

南方醫科大學1口腔醫學院；2南方醫院，廣東 廣州 510515

表觀遺傳學包括了DNA甲基化修飾，組蛋白共價修飾，染色質重塑，基因沉默和RNA編輯等調控機制。現今，表觀遺傳學已成為一大研究熱點[1]。在腫瘤治療機理中，大量的抗癌藥物是通過表觀遺傳調控達到腫瘤治療的目的[2-5]。除此之外，細胞成骨能力相關表觀遺傳學的機制研究也開始逐漸被人們所重視[6]。在口腔醫學領域，口腔來源的成體干細胞相關的表觀遺傳學研究，也逐漸被重視。并取得了部分成果。有研究闡述了牙髓細胞牙髓再生過程中，表觀遺傳學的調控[7]。然而，大量的深層的作用機制仍未被人們所了解。本文闡述了組蛋白去乙酰化酶調節細胞成骨的研究進展以及其在牙髓再生醫學中的應用前景。

1 組蛋白去乙酰化酶（HDAC）的概念與分類

Taunton等[8]首次從體內分離并證實了第一個組蛋白去乙酰化酶家族成員HDAC1的存在，并且認為其與基因沉默相關。組蛋白去乙酰化酶是一類蛋白酶，對染色質的結構修飾起重要的調控作用，并影響基因的轉錄表達。染色質由核小體組成，核小體由DNA雙鏈纏繞于組蛋白八聚體組成。組蛋白去乙酰化酶可以通過去除組蛋白氨基末端特定的賴氨酸殘基結合的乙酰基團，從而使染色質的結構致密卷曲，抑制基因的表達[9]。組蛋白去乙酰化抑制劑可以通過抑制其作用使染色質結構松弛、特定區域的基因暴露，從而促進基因的表達。隨著越來越多HDACs家族新成員的發現，根據結構，組蛋白去乙酰化酶可分為4大類[10-11]，Ⅰ類：HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8；Ⅱ 類 ：HDAC4、 HDAC5、 HDAC6、 HDAC7、HDAC9、HDAC10；Ⅲ類：沉默信息調節因子（SIRT）相關酶類；Ⅳ類：HDAC11。實驗證明，組蛋白去乙酰化酶不僅僅是作用于組蛋白，也可以作用基因片段，以及非組蛋白蛋白質[12-13]。

2 HDACs與成骨間的關系

2.1 Ⅰ類HDACs

Ⅰ類HDAC家族依其結構與酵母Rpd3具有同源性被歸為同一類，其中包括：HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8。因此，此類酶具有相似的結構域，與基因、蛋白以及組蛋白有相似的結合位點。但由于其不同組蛋白去乙酰化酶的其余結構差異，對于調節成體干細胞成骨/成牙本質向分化又有一定的特異性。

2.1.1 HDAC1 HDAC1與成骨向分化相關，最初其對于細胞成骨向分化的作用于2006年發現[14]，人原代骨髓細胞在成骨過程中，HDAC的表達水平會總體下降，其中HDAC1的表達改變尤其明顯。并且證實，HDAC1抑制后可促進成骨相關基因sterix、骨鈣素、骨橋蛋白和堿性磷酸酶的表達。研究發現，在C3h10t1/2細胞系骨向分化的過程中，HDAC1通過抑制RUNX2從而抑制其骨向分化[15]。HDAC1對于成骨分化的影響，與MircoRNA相關。2015年，在誘導多能干細胞中發現通過過表達miR-449a抑制HDAC1，可促進RUNX2的產生，以促進iPs的骨向分化[16]。說明HDAC1的產生，可以通過miR-449a進行調節。在體外細胞實驗中，大量文獻證明HDAC1可調節細胞的骨向分化。部分的體內實驗同樣證明了HDAC1與成骨密切相關。有研究發現，在婦女懷孕和哺乳期間，母體鈣會大量流失，從而導致母體骨量損失[17]。斷奶后，母體骨的合成水平上升。實驗表明，其機制是通過抑制HDAC1來促進RUNX2的轉錄活性從而促進母體骨的形成。實驗證明，多發性骨髓瘤的患者成骨功能不全，從而導致此類患者易發生骨折[18]。其機制是因為Runx2的p1啟動子被抑制，若抑制HDAC1的功能，可以激活Runx2的轉錄，從而促進成骨。

2.1.2 HDAC2 HDAC2的抑制不會直接引起骨細胞的終末分化。研究發現在人牙髓細胞中，抑制HDAC2后，骨鈣素的水平也下降[19]。因此其實驗團隊認為，HDAC2會刺激未成熟的成骨細胞的產生，其機制尚不明確。

2.1.3 HDAC3 HDAC3對于細胞成骨/成牙本質向分化過程的調控可能通過兩條途徑：（1）抑制HDAC3可促進Runx2靶基因的表達，從而促進成骨/成牙本質向分化。有研究發現，HDAC3調控RUNX2介導的細胞基因的轉錄從而促進成骨向分化[12]。（2）HDAC3抑制導致H3組蛋白上H3k9和H3k14位點被去乙酰化，過表達成骨相關因子，從而促進骨向分化。有研究發現，在人牙周膜干細胞骨向分化時HDAC3作用于H3組蛋白，使H3k9和H3k14位點被去乙酰化，過表達成骨相關因子，從而促進骨向分化[13]。

2.1.4 HDAC8 HDAC8活性抑制可以促進細胞成骨向分化。有實驗證明，在大鼠的骨髓間充質細胞中，抑制HDAC8的活性，增強組蛋白H3K9乙酰化水平從而促進成骨相關基因表達Runx2、Osterix、骨鈣素、骨橋蛋白和堿性磷酸酶，進而促進成骨[20]。

因此，大量實驗表明，Ⅰ類HDACs可通過與Runx2相互作用，從而影響Runx2靶基因的表達。或者，其直接去乙酰化H3組蛋白上的特定位點，導致成骨/成牙本質相關基因表達上調，以促進成骨/成牙本質向分化。可以推測，Ⅰ類HDACs具有相似的可與Runx2相結合的位點，從而影響細胞分化。

2.2 Ⅱ類HDACs

Ⅱ類HDAC家族依其結構與酵母Hda1具有同源性被歸為同一類，其中包括：HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7和HDAC9。因此，此類酶也具有相似的結構域，與基因、蛋白以及組蛋白有相似的結合位點。但根據其催化區域的不同，又被分為兩類：Ⅱa類具有一段催化區域，包括：HDAC4、HDAC5、HDAC7和HDAC9；Ⅱb類具有兩段催化區域，包括：HDAC6和HDAC10。目前尚無HDAC9和HDAC10對于成體干細胞成骨/成牙本質向分化調節相關研究，未來或可成為一研究熱點。而HDAC4、HDAC5、HDAC6和HDAC7相關研究也并未探明其機制。

2.2.1 HDAC4 HDAC4通過去乙酰化非組蛋白蛋白質以及成骨相關基因的啟動子區域，如Smurf-1、骨鈣素及Osx，從而影響細胞的礦化。研究表明，抑制HDAC4以抑制Runx2被降解，從而促進BMP2的產生[21-22]。與Ⅰ類HDACs的作用機制不同，HDAC4未直接與Runx2相結合，而是通過影響Smurf-1以調節Runx2的降解過程。有研究在成骨細胞中發現，HDAC4去乙酰化骨鈣素，使骨鈣素的結構穩定，從而促進細胞骨向分化[23]。實驗表明，HDAC4作用于Osx的K307和K312位點，使其去乙酰化，從而使其結構趨于穩定，促進骨向分化[13]。同時，可以促進Osx與DNA的結合，并增強其轉錄活性。

2.2.2 HDAC5 抑制HDAC5可促進成骨細胞分化，但是HDAC5在口腔來源的成體干細胞中促進骨向分化作用的研究有限。無法直接證明在口腔來源的成體干細胞中HDAC4、5對于成骨分化的影響。研究發現，HDAC5可以負向調節體內和體外的骨硬化蛋白水平[24]。在小鼠的ocy454骨細胞細胞株中，HDAC5結合并抑制MEF2C（為SOST的一個關鍵的轉錄因子）的表達，從而促進礦化。

2.2.3 HDAC6 在眾多與HDAC6相關的文獻中，更多的是在腫瘤領域中的應用。由于HDAC6被認為是異常蛋白降解的關鍵因子，因此，研究者多集中在其腫瘤治療用藥方面。然而，也有研究表明HDAC6與Runx2的啟動子可以結合以調節成骨向分化進程。有研究發現HDAC6特異性地和RUNX2的羧基末端相結合，從而使RUNX2從細胞質轉移到染色質[25]。在分化成骨細胞和前成骨細胞的過程中，Runx2的p21啟動子表達被HDAC6抑制，從而導致成骨細胞的早期分化啟動子受到抑制。

2.2.4 HDAC7 HDAC7被認為可能是成骨時間以及成骨細胞成熟率的重要調節因子。有研究發現，在C2C12細胞系中，HDAC7和RUNX2結合并抑制RUNX2的活性[26]。并且用RNA抑制劑沉默HDAC7后，會加速依賴BMP2的成骨分化過程。

2.3 Ⅲ類和Ⅳ類HDACs

目前為止，Ⅲ類HDACs與骨向分化的關系之間的研究較少，大多部分研究著眼于SIRT。有研究認為，SIRT通過抑制過氧化物酶體增殖物激活受體γ（重要的脂向分化調控因子），從而抑制細胞的脂向分化，間接促進細胞的骨向分化[27]。研究證明，SIRT是牙周膜細胞分化的重要調節因子，抑制SIRT可以促進牙周膜細胞的分化[28]。實驗證實，在小鼠胚胎干細胞中，胰島素和SIRT1共同作用于細胞，可以增加其成骨分化效率[29-30]。Ⅳ類HDACs，HDAC11組蛋白去乙酰化酶家族中作用最為特殊的一個，其作用被認為更多的是與染色質的結構以及定位相關，其在骨向分化過程中的作用不明。

3 HDACi對于細胞成骨/成牙本質向分化的作用

HADC的抑制大多是通過HDACi實現的，然而，大部分的HDACi并不會特異性地抑制某一種HADC，而是抑制某一類或幾類的HDACs。因此，不同的HDACi具有其特殊的作用。HDACi已在臨床中作為抗腫瘤的藥物廣泛應用。在牙源性的成體干細胞中，HDACi也可作為藥物直接使用。有研究認為組蛋白去乙酰化酶抑制劑和DNA甲基化抑制劑可作用于牙髓細胞并可應用于未來牙髓再生治療[31-32]。

3.1 TSA（HDACⅠ、Ⅱ、Ⅳ類抑制劑）的成骨作用

TSA可以促進細胞的成骨向分化。研究表明，TSA促進MC3T3-E1細胞產生堿性磷酸酶，加速基質礦化和成骨細胞的基因表達[33]。有研究發現，在骨髓間充質細胞中TSA可增強BMP9誘導的早期成骨標志物堿性磷酸酶活性，以及成骨標志物骨橋蛋白、骨鈣素和基質的礦化，證明HDAC抑制劑可以促進骨向分化[34]。骨髓間充質細胞是間充質來源的一類成體干細胞，口腔來源的成體干細胞也來源于間充質。因此，兩者具有某些相同的生物學特性。實驗證明，TSA促進人牙髓干細胞成牙本質向分化并會加強其增殖能力，在體外具有增強牙齒發育過程中牙本質形成和體內成牙本質細胞向分化的能力[35]。此外，TSA注射于胚胎表現出牙本質厚度增加以在免疫組化染色可見出生后磨牙牙本質細胞中，牙本質涎蛋白表達染色增強。有研究發現，TSA會促進人牙周膜干細胞的骨向分化，同時不影響細胞的存活以及活性。其實驗同時說明，在人牙周膜細胞的骨向分化過程中組蛋白H3的乙酰化水平增加，而HDACi作用于H3以促進骨向分化。這一實驗結果提供了牙周膜細胞作為種子細胞可被TSA刺激促進成骨，應用于牙再生治療的可能性。

3.2 SAHA（HDAC1和HDAC3的抑制劑）骨向分化的作用

SAHA同樣可以促進細胞成骨/成牙本質向分化。有研究發現，在C2C12細胞系以及HEK-293T細胞系骨向分化過程中，SAHA通過去乙酰化Runx2使其結構更穩定，從而增加Runx2的轉錄活性，并通過BMP-2來增強堿性磷酸酶的活性[21]。有實驗證明了短期、低劑量的在成骨誘導過程中加入SAHA可以通過調節基質金屬蛋白酶通路以及組織蛋白酶來促進牙髓干細胞的骨向分化[36-37]。SAHA可以促進基質金屬蛋白酶的表達，進一步促進礦化相關標記物的產生。

3.3 VPA（HDACs抑制劑）骨向分化的作用

低濃度VPA不影響細胞活力，同時可以促進細胞分化。有研究觀察到，在小鼠骨髓間充質細胞中VPA會促進細胞的成骨分化[38]。有學者發現，在人牙髓干細胞中，低濃度的VPA不影響細胞活力，增殖和細胞周期的分布[19]。同時，可以顯著增強基質礦化水平，并促進骨橋蛋白和骨涎蛋白的表達。

4 結論

HDACs在牙再生組織工程學中的應用前景。對牙齒發生發育和口腔疾病發生發展，具有重大的影響。在發現HADC后的20年里，大量的研究關注熱點在抗腫瘤的藥物應用之中。近幾年，HDAC對于細胞分化的調節作用以及其抑制劑對于促進組織再生的作用才開始受到重視。大量的研究結果表明HDAC具有應用于口腔再生醫學的巨大潛力。