花椒籽發酵做固體飼料的研究

劉希旻， 任 健， 童應凱*， 陳添傲， 平煒杰， 付同帥， 顧逸飛

（1.天津農學院農學與資源環境學院生物技術系，天津 300384；2.天津農學院基礎科學學院，天津 300384）

花椒籽富含蛋白質和粗脂質，并且資源豐富，是較好的脂肪源及蛋白源，然而花椒籽含有花椒酰胺類（麻味）物質和揮發油（香味）物質，會影響飼料的適口性。花椒酰胺雖然有抗炎抑菌的功能，但動物如果長期攝入會對胃部及腸道造成損傷（葉敏，2015）。花椒酰胺類物質中包括羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、羥基-γ-山椒素等。其中以羥基-α-山椒素的含量為酰胺類物質檢測的標準，主要采用紫外分光光度法檢測花椒酰胺的含量。本文通過對實驗室保藏菌種產朊假絲酵母（Candida utilis）、白地霉（Geotrichum candidum）、布拉迪酵母（Saccharomyces cerevisiae boulardii）及溫莎啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的培育和篩選，旨在確定降解花椒酰胺類物質的菌種，并通過正交試驗，尋找菌種的最佳生長條件及最佳生長元素添加量。以最大化地利用農后廢物花椒籽，為養殖業提供一種植物蛋白和脂肪源的新選擇。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 花椒籽粉、麩皮，市場購買；鮮花椒油，購自成都陳麻婆；石油醚、甲醛（分析純），甲醇（優級純），甲醇、正己烷（色譜純），購自天津大茂；葡萄糖（分析純），購自天津北方天醫；酵母浸膏（生化試劑，天津英博）；蛋白胨（生化試劑，湖北安琪）；酵母浸粉LP0021（生化試劑，英國OXOID）；硫酸銨、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵、氫氧化鈉（均為分析純，天津風船）；產朊假絲酵母、白地霉、布拉迪酵母、溫莎啤酒酵母，均為天津農學院生物技術系實驗室保藏菌種。

1.2 儀器與設備 粉碎機 （浙江榮浩）；分析天平（北京賽多利斯）；旋轉蒸發儀RE-2000A （上海亞榮）；紫外可見分光光度計（北京普析通用）；低速離心機L550（湖南湘儀）；恒溫水浴鍋HH-4（金壇市瑞華）；KH5200DB型超聲波清洗器（昆山禾創）；恒溫培養振蕩器（天津歐諾）；飛利浦紫外線燈（上海賴氏）；生物潔凈工作臺（蘇州安泰）；血細胞計數板（上海求精）；生化培養箱SHP-250B（江蘇宏凱）。

1.3 培養基 YEPD培養基：葡萄糖2%、酵母浸膏 1%、蛋白胨 2%，pH 6.0，121℃滅菌 20 min。

沙氏培養基：葡萄糖4%、蛋白胨1%，pH自然，121℃滅菌20 min。

中性紅油脂培養基：花椒油10%、酵母浸粉1%、硫酸銨0.2%、磷酸氫二鉀0.1%、磷酸二氫鉀0.3%、硫酸亞鐵0.01%、0.1%中性紅指示液0.3 mL，pH 7.2～7.5，121℃滅菌20 min。

固體發酵培養基：花椒籽粉9 g、麩皮1 g、蒸餾水10 mL，pH自然，121℃滅菌20 min。

1.4 試驗方法

1.4.1 花椒籽中油脂含量的測定 國標規定飼料粗脂肪含量為10%以上（含10%）。本試驗采用抽提法測定花椒籽中油脂含量（馬榮萱等，2006）。稱取8 g花椒籽粉，濾紙包好置于索氏提取器中，加入80 mL石油醚，置90℃水浴，回流虹吸15次停止加熱，待冷卻后，減壓蒸餾，直至無提取劑氣味，即為花椒籽油脂（表1）。

表1 花椒籽中油脂含量測定表

1.4.2 油脂降解菌的篩選 飼料中脂肪過多，會引起動物消化不良、腹瀉，且不利于存儲，因此需進行油脂降解菌的篩選。將產朊假絲酵母、白地霉、布拉迪酵母、溫莎啤酒酵母接種于中性紅油脂培養基上，置于生化培養箱中28℃培養48 h后進行觀察。

1.4.3 花椒酰胺類物質標準品的制備 羥基-α-山椒素制備參照劉福權等（2017）的方法。花椒油與甲醇按體積比1:20，于40℃，160 r/min振蕩1 h后，超聲5 min。4000 r/min離心15 min，取上清液加入正己烷，體積比為1:2，萃取3次除去香味物質。將下層液過堿性三氧化二鋁層析柱，所得液經0.22μm濾膜過濾后，進行減壓蒸干，得到粗提取物。將粗提取物溶于10 mL色譜純甲醇，于紫外燈下15 cm處照射4 h，再進行減壓蒸干。經甲醛滴定法平行檢驗 （江燕竹，2016），獲得純度為98.21%的羥基-α-山椒素標準品。

1.4.4 花椒酰胺類物質標準曲線的測定 將制取的羥基-α-山椒素標準品溶于一定量的甲醇中，再配制成不同濃度的溶液，在254 nm下測定吸光度，繪制標準曲線（圖1）。

圖1 羥基-α-山椒素含量標準曲線

1.4.5 花椒酰胺類降解菌的篩選 將產朊假絲酵母、布拉迪酵母、溫莎啤酒酵母接種于50 mL YEPD培養基中，白地霉接種于50 mL沙氏培養基中，于搖床中30℃，150 r/min培養24 h后，移取1 mL種子液接種于固體發酵培養基中。置于生化培養箱中28℃培養48 h，將發酵產物各精確稱取1.00 g移入10 mL離心管中，加入5 mL甲醇，在40℃下浸提4 h，其間不斷搖動，離心后取上清液稀釋，在254 nm處測定其吸光度值（付陳梅等，2003）（表 2）。

表2 不同菌種降解花椒酰胺類物質殘留量比m較g/g

1.4.6 微量元素正交試驗 對產朊假絲酵母、白地霉，單一菌種及混合菌種進行L9（34）的固體發酵生長元素添加條件試驗設計見表3。

表3 微量元素添加條件正交試驗設計表%

1.4.7 生長條件正交試驗 對產朊假絲酵母進行L9（34）的生長條件試驗設計見表 4。

表4 產朊假絲酵母、白地霉混合發酵生長條件正交試驗設計表

2 結果與分析

微量元素正交試驗結果分析見表5和表6。由R值可知，影響產朊假絲酵母降解的微量元素添加條件依次為葡萄糖、硫酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂；影響白地霉降解的微量元素添加條件依次為硫酸銨、葡萄糖、硫酸鎂、磷酸二氫鉀。

表5 產朊假絲酵母、白地霉單一菌種發酵微量元素添加條件正交試驗結果

表6 產朊假絲酵母、白地霉單一菌種發酵微量元素添加條件顯著性比較（LSD法）

由R值可知，影響產朊假絲酵母、白地霉混合發酵降解的微量元素添加條件依次為硫酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、葡萄糖（表7、表8）。

由R值可知，影響產朊假絲酵母、白地霉混合發酵降解的生長條件依次為接種量、時間、料液比、溫度（表 9、表 10）。

3 結論

本試驗結果表明，固體發酵降解花椒酰胺類物質的最優混合菌種為產朊假絲酵母和白地霉。對比單一菌種發酵，混合菌種降解花椒酰胺類物質時間短，降解能力高，并大大降低了花椒籽粉中的揮發油類（香味）物質。經正交試驗確定混合菌種的最佳降解生長條件為：溫度28℃，料液比1:1，接種量10%，時間24 h。生長元素添加最佳條件為：（NH4）2SO40%，KH2PO40.2%，Mg-SO40.01%，葡萄糖0.5%。經重復試驗驗證，花椒酰胺類物質平均殘留量為3.5776 mg/g。且發酵產物經感官性評價無花椒揮發油氣味，麻味明顯下降，油脂含量適中。

表7 產朊假絲酵母、白地霉混合發酵微量元素添加條件正交試驗結果

表9 產朊假絲酵母、白地霉混合發酵生長條件正交試驗結果

表8 產朊假絲酵母、白地霉混合發酵微量元素添加條件顯表著性比較（LSD法）

10 產朊假絲酵母、白地霉混合發酵生長條件顯著性比較（LSD法）