不同釀酒酵母體外模擬胃腸道內環境適應性研究

龔發源 ， 徐智鵬 ，， 陳毛清 ，曹詩國 ， 熊 鋒 ， 曾雨雷 ， 胡駿鵬 ，*

（1.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌 443003；2.安琪酵母（崇左）有限公司，廣西崇左 532201）

從20世紀初開始，飼用益生菌以其無毒副作用、無殘留、無環境污染、能有效提高動物生產性能而被廣泛研究并用于動物生產。目前用于畜禽飼料的益生菌，主要包括芽孢桿菌、腸球菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌、片球菌、鏈球菌等革蘭氏陽性菌以及釀酒酵母菌、克魯維酵母菌等 （Anadon等，2006）。其中釀酒酵母是安全使用時間較長且具有顯著益生作用的飼用微生物，其菌體蛋白質含量高達50%以上，在畜牧業中一直作為單細胞蛋白的主要來源而被廣泛使用（聶琴，2018）。此外釀酒酵母作為益生菌可以提高動物對飼料干物質、纖維素、半纖維素、蛋白質等有機物和磷酸的消化率，還能提高飼料中礦物質利用率，有助于動物充分利用飼料中的養分，同時還能有效改善家畜腸胃的菌群結構（潘寶海等，2010；王學東等，2006）、吸附腸道病原菌（Tiago等，2012）、增強家畜的免疫力和抗病力（Halas等，2012）等。

然而，動物胃腸道中存在的胃酸、膽鹽及各種消化酶類是天然存在的屏障，飼用益生菌能否在動物消化道中發揮生理功能，首要在于能否有效抵抗胃腸道的天然屏障，在消化道內定植或者保持有效活菌含量。因此，本研究選取多種釀酒酵母菌株，建立體外模擬胃腸道環境模型，對釀酒酵母菌株在模擬胃腸道環境中的適應性進行評價，為飼用釀酒酵母科學有效的使用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株 釀酒酵母菌株及活性干酵母樣品：Sc 1、Sc 2、Sc 3、Sc 4 均由安琪酵母股份有限公司提供，其中Sc 1菌株保存于安琪酵母股份有限公司生物技術研究院菌種保藏中心，菌種編號BW；Sc 2、Sc 3、Sc 4保存于武漢大學中國典型培養物保藏中心 （CCTCC），菌種編號分別為CCTCC M2051226、CCTCCM2016460、CCTCC M2012116。

1.1.2 培養基及主要試劑 酵母膏胨葡萄糖（YPD）液體和固體培養基：1% 酵母提取物，2%蛋白胨，2% 葡萄糖，溶解于1 L蒸餾水中，若制固體培養基，加入2%瓊脂粉，滅菌待用。

豬膽鹽（膽酸含量≥65%），購自北京奧博星生物技術有限公司；胃蛋白酶（酶活力≥1200 U/g）、胰蛋白酶（酶活力≥5000 U/g），氯化鈉、濃鹽酸、氫氧化鈉等化學試劑（生化級），購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化 從4℃冰箱中取出斜面培養基保存的釀酒酵母菌株，室溫解凍后，接種于YPD斜面培養基進行活化，再將活化好的菌種接種到YPD液體培養基進行擴培。培養至對數生長期末期后作為活化酵母菌懸液，待用。

1.2.2 37℃生長試驗 將活化的菌懸液接種于YPD液體培養基（pH自然），接種量1‰，37℃下搖床培養，0、4、8、12、24 h 后進行活菌計數（cfu/mL）。

1.2.3 酸性環境適應性試驗 將活化的菌液接種于不同 pH 液體培養基 （pH 1.0、2.0、3.0、4.0），使用自然pH作為對照，接種量1‰，最適生長溫度下搖床培養，24 h后進行活菌計數（cfu/mL）。

1.2.4 人工胃液配制 取質量濃度為0.1 kg/L的鹽酸16.4 mL，加蒸餾水稀釋，調節溫度為25℃，用pH計精密調節pH為2.0。然后參考GB/T 17811-1999相關方法，加入生化級胃蛋白酶（1%），充分溶解后，用孔徑0.22μm微孔濾膜過濾除菌，即為人工胃液。

1.2.5 人工腸液配制 Na2HPO41.36 g，加水100 mL溶解，用0.1 kg/L鹽酸溶液調節pH至6.8，加水稀釋至200 mL，121℃滅菌15 min，然后加入0.3%膽鹽和0.1%生化級胰蛋白酶，充分溶解后用孔徑0.22μm微孔濾膜過濾除菌，冷藏備用。

1.2.6 活菌培養計數 用無菌生理鹽水對樣品進行10倍梯度稀釋，每支樣品選擇3個稀釋梯度，每個稀釋度3個重復，采用平板計數法，吸取0.1 mL進行無菌涂布，靜置15 min后30℃倒置恒溫培養24 h，計數有效數在30～300個的平板菌落數，然后將結果換算成cfu/mL。

1.3 數據處理 試驗數據以“平均數±標準差”表示，采用SPSS 18.0統計軟件中的one-way ANOVA進行單因素方差分析，用Duncan’s法進行多重比較，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結果與分析

2.1 37℃生長試驗 由圖1可知，四種釀酒酵母菌株在37℃的YPD肉湯條件下均能夠生長增殖，0～4 h為適應期，4～12 h為對數生長期，16～24 h為平臺生長期，36 h顯示活菌數相對平臺期已經出現衰亡。四種釀酒酵母菌株之間對比發現，Sc 1對數生長速率最大，菌株迅速擴增，Sc 2次之；Sc 4能夠達到最大活菌數108cfu/mL，Sc 2次之；Sc 1雖然在對數生長期快速增殖，但是最大活菌數卻只有107cfu/mL左右。綜合而言，Sc 2在37℃具有較好的生長適應性，Sc 4能夠達到最大活菌數。

圖1 不同釀酒酵母菌株在37℃條件下生長曲線

2.2 酸性環境適應性試驗 如圖2所示，與自然pH的對照組相比，pH 1.0的條件下培養24 h后活菌數基本都在接種值105cfu/mL以下，說明pH 1.0的條件會顯著抑制4株釀酒酵母的生長；pH 2.0條件下培養24 h后，除Sc 3和Sc 4外活菌數都在接種值105cfu/mL左右，無明顯生長增殖；而pH 3.0和pH 4.0的條件中，4株釀酒酵母均能夠正常生長。另外不同pH條件下對比4株釀酒酵母菌株之間生長情況發現，Sc 1對酸性環境的適應性最差，其他3株釀酒酵母都顯著（P＜0.05）或者極顯著（P ＜ 0.01）優于 Sc 1；而 Sc 2、Sc 3、Sc 4 之間并沒有顯著性差異（P＞0.05），說明除Sc 1外，其他3株釀酒酵母都具有較好的酸性環境適應性。

圖2 不同釀酒酵母菌株酸性環境適應性

2.3 人工胃液耐受性試驗 人工胃液耐受性試驗選擇4株釀酒酵母菌株為種子生產的商品化活性干酵母產品（酵母活細胞數≥200億個/g），通過平板計數加入人工胃液后0、2、4 h的酵母活菌數，計算不同時間點相對0 h的存活率，結果如表1所示。在pH 2.0，胃蛋白酶1%的模擬人工胃液中共同孵育2 h后，4種釀酒酵母的相對存活率為50%～70%，其中Sc 3的存活率最高，達到69.72%，Sc 1存活率最低，為50.07%，兩者差異極顯著（P＜0.01）。而共同孵育4 h后，4種釀酒酵母的相對存活率為45%～61%，Sc 4最高，存活率為60.58%，Sc 1最低，存活率為46.16%。綜合而言，0～2 h時間段內，釀酒酵母衰亡明顯，而2～4 h內相對存活率下降5%左右；其中，Sc 4在模擬人工胃液中的耐受性綜合表現最佳。

表1 人工胃液對不同釀酒酵母相對存活率的影響%

2.4 人工腸液耐受性試驗 人工腸液耐受性試驗同樣是使用商品化活性干酵母產品 （酵母活細胞數≥200億個/g），通過平板計數計算不同時間點相對0 h的存活率，結果如表2所示，在pH 6.8、膽鹽濃度0.3%、胰蛋白酶0.1%的模擬人工腸液中共同孵育2 h后，相對存活率為54%～72%，Sc 3的存活率最高，Sc 1存活率最低，兩者差異極顯著（P＜0.01）。共同孵育4 h后，4種釀酒酵母的相對存活率為45%～67%，Sc 3最高，存活率為66.25%，Sc 1最低，存活率為45.27%。綜合而言，Sc 3在模擬人工腸液中的耐受性最佳。

表2 人工腸液對不同釀酒酵母相對存活率的影響%

3 討論

釀酒酵母作為一個種屬，本身包含多種菌株，不同菌株之間在生理生化特性上存在一定的差異。優良的飼用釀酒酵母需要具有耐受動物胃腸道內環境的能力，主要包括胃液壓力和腸液壓力，否則無法在動物胃腸道中發揮應有的生物學功效。胃腸道環境耐受性試驗已經成為飼用益生菌篩選的一個必要內容。李順（2007）篩選飼用活性酵母時，通過pH 2.1或者含豬膽鹽0.3%的麥芽汁培養基中接種酵母菌，培養24 h，選擇能夠生長增殖的作為具有抗逆性的目標菌株；王鵬（2011）對分離的釀酒酵母菌株耐受性研究發現，該菌株在pH 2.0麥芽汁培養基中存活率為58.92%，pH 3.0麥芽汁培養基中存活率為91.95%，pH 4～7的培養基中都可以正常增殖；同時在0.6%膽鹽濃度麥芽汁培養基中培養12 h后，依然能夠增殖；肖新云等（2016）研究漢遜德巴利酵母在胃酸、腸膽鹽環境的耐受性時發現，該菌株在pH 1.0的PDA培養基中無存活，pH 1.5、2.0、2.5活菌數與對照組比較下降明顯 （P＜0.01），耐膽鹽試驗中，該菌株在0.4%的高膽鹽濃度PDA培養基中仍然存活，活菌數隨膽鹽濃度增加而降低，具有良好的抗酸、抗膽鹽特性；王學東等（2018）研究不同用途酵母菌環境適應性差異發現，飼用酵母菌的酸脅迫耐受性和膽酸鹽耐受性都優于面包酵母和酒精酵母，同時發現不同菌株的酸脅迫耐受性可能與其細胞內Na+、K+濃度變化有密切關系，膽酸鹽耐受性可能與其胞內海藻糖積累量密切相關，與本試驗結果基本一致，4株釀酒酵母菌株在體外模擬胃腸道環境的耐受性是不同的，Sc 2、Sc 3、Sc 4比Sc 1具有更好的酸性環境適應性。此外本研究考慮到養殖生產過程中的實際情況，分別使用其活性干酵母制劑在考察模擬胃腸道環境中的耐受性，發現不同用途的釀酒酵母的耐受性存在較大差異。綜上，同一種屬的菌種之間其環境抗逆性是存在差異的，因此選擇畜禽養殖專用的益生菌，一定要綜合評價菌株本身對于胃腸道環境的耐受性，這是其發揮改善腸道菌群，促進飼料消化等生理功能的前提。

4 結論

本試驗結果表明，不同釀酒酵母在體外模擬胃腸道內環境的適應性不同，釀酒酵母Sc 2、Sc 3、Sc 4比釀酒酵母Sc 1具有更好的胃腸道耐受性。因此在篩選和應用飼用釀酒酵母過程中需要篩選具有胃腸道環境耐受性的菌株，而相關的體外模擬研究方法還需要不斷的優化驗證。