蒽酮硫酸比色法測甜菊素含量

周墨哲

摘 要：本實驗確定了用蒽酮硫酸比色法測量甜菊素含量的方法，該方法的實驗原理為甜菊素在酸性條件下水解為葡萄糖，葡萄糖與蒽酮試劑反應，生成藍綠色物質，在620nm處有吸收。吸收度與甜菊素的濃度有一定的線性關系。此方法和中國藥典方法對比分析時間更短，操作更簡便。同時，本文對該方法進行了方法學驗證，證明其精密度、準確度、線性、耐用性等均符合定量測定的要求。

關鍵詞：甜菊素;硫酸蒽酮顯色法;含量測定

中圖分類號：R927 文獻標識碼：A 文章編號：1671-2064（2019）02-0207-02

甜菊素（又稱甜菊糖苷）為甜葉菊葉子的主要甜味物質，從甜菊葉中提取出的甜菊素呈結晶狀，其甜度為砂糖的200倍。甜菊素是萊鮑迪甙A、萊鮑迪甙B、等的混合物。由于熱量低、易溶于水或酒精，也具耐熱性，是無熱量之代糖產品，是糖尿病患者的飲食或瘦身食品常用的甜味料。甜菊糖作為一種新型甜味劑，廣泛應用于各類食品、飲料、醫藥、日化工業。所有國際監管組織均將甜菊糖視為安全食用品。這些組織包括：食品規范委員會（CAC）、聯合國糧食農業組織/世界衛生組織食物添加劑聯合專家委員會（JECFA）、歐洲食品安全局（EFSA）、美國食品和藥物管理局（FDA）和新西蘭食品標準管理局（FSANZ）。

甜菊素在中國被收載入《中國藥典》2015版，在藥物制劑中作為甜味劑。《中國藥典》2015版用容量法測定甜菊素的含量，具體為：取本品約0.3g，精密稱定，置250ml錐形瓶中，加稀硫酸25ml與水25ml，振搖溶解后，加熱至微沸，水解30分鐘，冷卻，濾過，濾渣用水洗至中性后，加中性乙醇（對酚酞指示液顯中性）50ml，溶解后，再加酚酞指示液2滴，用乙醇制氫氧化鉀滴定液（0.05mol/L）滴定至溶液顯紅色，10秒鐘內不褪。根據氫氧化鉀滴定液的消耗量計算甜菊素含量。

本實驗用蒽酮硫酸比色法測甜菊素含量。具體原理為：甜菊素在酸性條件下水解為葡萄糖，葡萄糖與蒽酮試劑反應，生成藍綠色物質，在620nm處有吸收。吸收度與甜菊素的濃度有一定的線性關系。此方法和中國藥典方法對比分析時間更短，操作更簡便。實驗內容如下：

1 蒽酮硫酸顯色條件確定

根據反應原理，甜菊素在酸性條件下水解為葡萄糖，水解生成的葡萄糖與蒽酮在加熱和酸性條件下顯色，在620nm產生吸收。所以，本實驗的甜菊素水解和顯色的條件至關重要。我們對實驗條件的確定做了如下實驗：

供試樣品溶液為100ppm的甜菊素溶液。取一定量的蒽酮溶解于濃硫酸中，置于棕色試劑瓶，混合均勻后放于冰箱中保存（現配現用）。考察硫酸濃度、蒽酮含量、試劑用量、反應溫度、反應時間對吸光度的影響，各因素下選取的選取的水平點分別為硫酸濃度：65%、75%、85%、98%;蒽酮質量與硫酸體積比：0.1%、0.2%、0.3%、0.4%;樣品溶液與試劑的體積比：1：2、1：4、1：6、1：8;反應溫度：40℃、60℃、80℃、100℃;反應時間：7min、8min、9min、10min。其結果見表1。

由上述實驗結果得到蒽酮硫酸顯色法最佳顯色條件為：

（1）蒽酮硫酸試劑的濃度為0.3%（即0.3g蒽酮溶解于100ml硫酸中）

（2）供試品甜菊素溶液的濃度為100ppm，用2ml甜菊素溶液與8ml蒽酮硫酸試劑反應。

（3）將2ml甜菊素溶液與8ml蒽酮硫酸試劑在100℃的水浴中加熱7min，在620nm處檢測其吸光度。

我們確定的蒽酮硫酸比色法測甜菊素含量具體方法為：精密稱取甜菊素供試品0.1g，置于100ml容量瓶中，定容至刻度，精密吸取上述溶液10ml，置于100ml容量瓶中，定容至刻度，作為供試品溶液。精密吸取供試品溶液2ml于10ml容量瓶中，用硫酸蒽酮試劑（0.3g蒽酮溶解于100ml 98%硫酸中）定容至刻度，混勻，在100℃的水浴中加熱7～10min，冷卻至室溫，在620nm處檢測其吸光度。另取甜菊素對照品，同法操作。按下列公式計算供試品甜菊素含量：

甜菊素含量=對照品稱樣量*供試品吸光度*對照品含量/供試品稱樣量*對照品吸光度

2 線性

按照確定的實驗條件，分別用25、50、100、150、200ppm的甜菊素供試品溶液與顯色劑顯色后測吸光度，考察在含量測定濃度25～200%范圍內的線性。實驗數據如表2。

用蒽酮-硫酸法測定甜菊素在620nm處的吸光度，標準曲線如圖1所示，以吸光度（A）對甜菊素濃度（C）作回歸處理，求回歸方程為A=0.0046C -0.0023（R2=0.9998），甜菊素濃度在20～200ppm范圍內呈良好的線性關系。

3 準確度實驗

為考察硫酸蒽酮顯色法測甜菊素含量的準確度，我們用《中國藥典2015年版》甜菊素含量測定方法作為經典方法，分別按各自確定的實驗方法平行測定六次。用兩組含量測定結果的比值（回收率）來考察硫酸蒽酮顯色法的準確度，結果見表3、表4。

由表可知，蒽酮硫酸顯色法測定的結果與參考方法測定的結果分別為97.4%和96.9%，回收率=97.4/96.9=100.5%。蒽酮硫酸顯色法測甜菊素含量準確度符合要求。

4 精密度實驗

為考察本方法的精密度（即重現性），我們分別在設計測試濃度的0.8倍、1倍、1.2倍進行了考察。具體如下：

4.1 相當于檢測濃度1倍的精密度實驗

按確定的硫酸蒽酮顯色法測甜菊素含量，即精密稱取甜菊素供試品0.1g，置于100ml容量瓶中，定容至刻度，精密吸取上述溶液10ml，置于100ml容量瓶中，定容至刻度，作為供試品溶液。精密吸取供試品溶液2ml于10ml容量瓶中，用硫酸蒽酮試劑（0.3g蒽酮溶解于100ml硫酸中）定容至刻度，混勻，在100℃的水浴中加熱7min，之后迅速放入冰浴中冷卻10min，在620nm處檢測其吸光度。

平行測定6次，結果如表5所示。

相當于檢測濃度1.0倍的精密度實驗RSD=0.34%，重現性好。

4.2 相當于檢測濃度1.2倍的精密度實驗

精密稱取甜菊素供試品0.12g，置于100ml容量瓶中，定容至刻度，精密吸取上述溶液10ml，置于100ml容量瓶中，定容至刻度，作為供試品溶液。精密吸取供試品溶液2ml于10ml容量瓶中，用硫酸蒽酮試劑（0.3g蒽酮溶解于100ml硫酸中）定容至刻度，混勻，在100℃的水浴中加熱7min，之后迅速放入冰浴中冷卻10min，在620nm處檢測其吸光度。

平行測定6次，結果如表6所示。

相當于檢測濃度1.2倍的精密度實驗RSD=0.50%，重現性好。

4.3 相當于檢測濃度0.8倍的精密度實驗

按確定的硫酸蒽酮顯色法測甜菊素含量，即精密稱取甜菊素供試品0.08g，置于100ml容量瓶中，定容至刻度，精密吸取上述溶液10ml，置于100ml容量瓶中，定容至刻度，作為供試品溶液。精密吸取供試品溶液2ml于10ml容量瓶中，用硫酸蒽酮試劑（0.3g蒽酮溶解于100ml硫酸中）定容至刻度，混勻，在100℃的水浴中加熱7min，之后迅速放入冰浴中冷卻10min，在620nm處檢測其吸光度。

平行測定6次，結果如表7所示。

相當于檢測濃度0.8倍的精密度實驗RSD=0.40%，重現性好。

小結：在設計濃度的0.8倍、1倍、1.2倍的精密度實驗RSD分別為0.40%、0.34%、0.5%，本方法的重現性好。

5 耐用性實驗

按確定的硫酸蒽酮顯色法測甜菊素含量的方法，將顯色后的甜菊素樣品溶液分別放置15min、30min、45min、60min、90min、120min，考察其穩定性，結果如表8所示。

如表8所示，顯色后的樣品溶液在2小時內的吸光度沒有明顯的變化，RSD=0.75%，也就是，顯色后的溶液的吸光度是穩定的，該方法耐用性好。

6 結語

蒽酮硫酸試劑比色法用于測定甜菊素含量的準確度、精密度、線性均符合定量分析的要求，是可行的。且該方法比藥典方法操作更省時，操作步驟少。

參考文獻

[1]中國藥典委員會.中國藥典2015版[M].北京：化學工業出版社，2015.

[2]常麗娟.甜菊糖苷化學研究法概況：國外醫學衛生學分冊[J].2007，（3）197-200.