解毒祛瘀滋陰方對H22荷瘤小鼠腫瘤生長及免疫功能的影響

張婷婷 周琢艷 李俊峰 劉文洪

浙江中醫藥大學 浙江 杭州 310053

解毒祛瘀滋陰方是范永升教授治療系統性紅斑狼瘡的臨床經驗方，本實驗探討其對荷瘤小鼠腫瘤生長及其免疫功能的影響。

1 實驗材料

1.1 實驗動物及H22瘤株：昆明小鼠雄性24只，4～6周齡，體質量18～22g，由浙江中醫藥大學動物中心提供。實驗動物合格證號：SYXK（浙）2013-0184。H22瘤株購自浙江中醫藥大學動物實驗中心。

1.2 藥材與試劑：解毒祛瘀滋陰方由干地黃、白花蛇舌草、積雪草、薏苡仁各12g，鱉甲、青蒿、赤芍各10g，升麻20g，佛手8g，甘草6g等藥物組成，購自浙江中醫藥大學中醫門診部。5-氟尿嘧啶（5-FU）、小鼠白細胞介素-2（IL-2）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、ELISA檢測試劑盒購自上海源葉生物有限公司。

2 實驗方法

2.1 模型制備及分組：實驗用小鼠均按常規方法接種腫瘤細胞，取自行小鼠腹腔傳代7天的H22瘤株，無菌條件下抽取生長良好的乳白色腹水液，以0.9%氯化鈉溶液1:1稀釋，經0.2%臺盼藍染色后計算活細胞數＞95%，調整瘤細胞懸液為1×108個/ml瘤細胞，以每只0.2ml的劑量接種于小鼠右側腋窩下。接種次日將小鼠隨機分為3組：病理模型組、五氟尿嘧啶（陽性藥）組、解毒祛瘀滋陰方（中藥）組，每組8只。

2.2 藥物制備及給藥方法：將解毒祛瘀滋陰方以10倍水煎煮2h，過濾；等體積水再次煎煮2h，過濾；合并濾液，并濃縮至含藥量1g/ml。根據人與小鼠藥物劑量換算公式算出小鼠每日給藥劑量。病理模型組予以生理鹽水20ml/kg，每日1次；陽性藥組腹腔注射五氟尿嘧啶0.1ml/10g，每日1次；解毒祛瘀滋陰方（中藥）組予以18mg/kg濃縮液灌胃，每日1次。連續給藥10天。

2.3 體質量及腫瘤生長：于給藥前和停藥24h后以分析天平各測體質量1次。末次給藥24h各組小鼠眼球采血后，以頸椎脫臼法處死，從腋部皮下完整剝離腫瘤組織，稱量腫瘤質量，計算抑瘤率。抑瘤率（%）=（病理模型組平均瘤質量-實驗組平均瘤質量）/病理模型組平均瘤質量×100%。

2.4 免疫器官指數的測定：小鼠處死后快速剝離脾臟和胸腺并稱質量，計算脾臟和胸腺指數。臟器指數=臟器質量/動物質量。

2.5 小鼠血清IL-2、TNF-α含量的測定：給藥10d后，實體瘤小鼠摘眼球取血0.5～1.0ml，4℃3000r/min離心15min，取血清置于-20℃保存，IL-2、TNF-α試劑盒測定。

2.6 統計學方法：采用SPSS 19.0統計軟件對數據進行處理分析，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05認為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 解毒祛瘀滋陰方對H22荷瘤小鼠實體瘤生長的影響：與病理模型組對比，解毒祛瘀滋陰方組給藥后體質量明顯增高，瘤質量顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。與五氟尿嘧啶組對比，解毒祛瘀滋陰方組給藥后體質量明顯增高，差異有統計學意義（P＜0.05），瘤質量無明顯差異。提示解毒祛瘀滋陰方組能抑制H22實體瘤的生長。陽性藥組與解毒祛瘀滋陰方組抑瘤率均達到30%以上，說明五氟尿嘧啶與解毒祛瘀滋陰方對腫瘤生長具有明顯抑制。詳見表1。

表1 解毒祛瘀滋陰方對H22實體瘤生長的影響（±s）

注：與病理模型組比較，*P＜0.05；與陽性藥組比較，ΔP＜0.05。

抑瘤率-45.91%76.28%組別病理模型組陽性藥組中藥組例數8 8 8體質量（g）給藥前27.78±0.96 26.85±0.95 27.82±1.57給藥后38.50±0.54 40.15±2.12 43.78±3.22*Δ瘤質量（g）1.89±0.70 1.10±0.45 0.44±0.22*

3.2 解毒祛瘀滋陰方對H22荷瘤小鼠臟器指數的影響：與病理模型組對比，解毒祛瘀滋陰方組胸腺指數明顯增高，差異有統計學意義（P＜0.05）。與病理模型組對比，五氟尿嘧啶組胸腺指數明顯降低，差異具有統計學意義（P＜0.01）。與五氟尿嘧啶組對比，解毒祛瘀滋陰方組胸腺指數顯著增高，差異有統計學意義（P＜0.01）。而脾臟指數病理模型組、解毒祛瘀滋陰方組與陽性藥組均無明顯差異。詳見表2。

表2 H22荷瘤小鼠臟器指數（±s，%）

表2 H22荷瘤小鼠臟器指數（±s，%）

注：與病理模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與陽性藥組比較，ΔΔP＜0.01。

脾臟指數63.20±7.22 80.40±13.84 77.42±13.10組別病理模型組陽性藥組中藥組例數8 8 8胸腺指數22.03±2.14 10.16±3.10**32.82±6.54*ΔΔ

3.3 ELISA法測定細胞因子：與病理模型組和五氟尿嘧啶組對比，解毒祛瘀滋陰方組明顯提高血清中IL-2和TNF-α水平（P＜0.05）。五氟尿嘧啶組與病理模型組對比并無明顯差異。詳見表3。

表3 ELISA法測定細胞因子（±s，pg/ml）

表3 ELISA法測定細胞因子（±s，pg/ml）

注：與病理模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與陽性藥組比較，ΔΔP＜0.01。

TNF-α 82.67±1.15 81.00±3.01 89.95±5.53**ΔΔ組別病理模型組陽性藥組中藥組例數8 8 8 IL-2 30.59±4.00 28.60±4.02 41.11±8.12*ΔΔ

4 討論

前期研究表明解毒祛瘀滋陰方可以增強RAW264.7巨噬細胞吞噬功能，調節免疫功能[1]，故進一步探討解毒祛瘀滋陰方的抗腫瘤功效。該方以干地黃清熱涼血益陰為君，白花蛇舌草、升麻清熱解毒消斑為臣，炙鱉甲補陰益腎退熱，赤芍、積雪草活血散血俱為佐藥，青蒿退熱，芳香體輕，開胃養脾，疏理少陽氣機，炒薏苡仁、佛手片、生甘草調和脾胃，疏理氣機，調和諸藥為使。諸藥合用，共奏清熱解毒、活血化瘀、益腎養陰之功，為腫瘤的治療提供了新的方向。

本實驗結果表明，解毒祛瘀滋陰方對荷瘤小鼠的實體瘤生長具有明顯抑制作用，并提高其血清細胞因子IL-2、TNF-α水平。IL-2是T細胞在體外生長所必需的細胞因子，它可促進已活化的T細胞增殖分化成熟為效應遲發型超敏反應T細胞和細胞毒性T細胞(CTL)，并可調節B細胞、NK細胞和巨噬細胞的免疫功能[2]。腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)往往對各種抗原沒有反應，增殖活性低下，加入IL-2后可以逆轉這種無反應狀態以證明其在腫瘤免疫過程中起到良好作用[3]。TNF-α是細菌脂多糖作用于單核巨噬細胞釋放的一種多肽類物質，對腫瘤有直接溶解和抗腫瘤作用，還能增強炎癥部位單核巨噬細胞系統活性及NK細胞的細胞毒作用[4]。解毒祛瘀滋陰方組通過增強IL-2、TNF-α釋放，以達到調節T細胞、B細胞、NK細胞、巨噬細胞等免疫相關細胞功能，逆轉TIL的無反應狀態，并作用于血管內皮細胞，損傷內皮細胞或導致血管功能紊亂，使血管損傷和血栓形成，造成腫瘤組織的局部血流阻斷而發生出血、缺氧壞死，起到直接殺傷或抑制腫瘤作用。陽性組藥物5-FU為抗代謝藥物，對胸腺骨髓有著明顯抑制作用，而解毒祛瘀滋陰方在抑制腫瘤生長的同時，增強其胸腺指數，調節其免疫功能。其在抗腫瘤免疫中所起的重要作用，為腫瘤治療提供新的科研方向，并為臨床用藥提供新的思路與方法。但實驗仍存在不足之處，動物腫瘤模型存在個體差異會影響實驗結果，后續仍需繼續進一步研究。