白藤梨根提取物體內(nèi)外抗腫瘤作用研究*

張家敏 張 騁 王 鵬 王建英 王楠楠 朱婉萍#

1 浙江省金華市人民醫(yī)院 浙江 金華 321000

2 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 浙江 杭州 310003

3 浙江省中醫(yī)藥研究院 浙江 杭州 310007

白藤梨根來源于獼猴桃科獼猴桃屬植物毛花獼猴桃（Actinidia erianthaBenth）的干燥根[1]，具有清熱、利濕、活血、消腫、解毒等功效，為浙江民間習(xí)用藥材。白藤梨根是畬族民間常用的藥材，被廣泛用于抗腫瘤的治療。現(xiàn)代臨床療效及基礎(chǔ)研究結(jié)果表明白藤梨根具有顯著的抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用[2-3]。本次以白藤梨根為研究對象，初步探討白藤梨根提取物體內(nèi)外抗腫瘤作用，為臨床應(yīng)用和新藥開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物：SPF級BALB/c-nu裸鼠40只，雄性，體重20±2g，購于浙江省實驗動物中心，許可證號：SCXK（浙）2014-0001，由浙江省中醫(yī)藥研究院實驗動物中心飼養(yǎng)。

1.2 細(xì)胞株：人肺癌A549細(xì)胞株均購于中科院細(xì)胞庫，由浙江省中醫(yī)藥研究院實驗室液氮保存。

1.3 藥物：白藤梨根采自浙江省武義縣，經(jīng)金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院中藥學(xué)專業(yè)吳遠(yuǎn)文副教授鑒定為獼猴桃科獼猴桃屬毛花獼猴桃（Actinidia erianthaBenth）的干燥根；RPMI-1640培養(yǎng)液(批號：16011505）、0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA，批號：2016062902)、PBS（批號：2016061304）均購于吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；胎牛血清(批號：20160323)購于浙江天杭生物科技股份有限公司；注射用環(huán)磷酰胺（Baxter，批號：6F124A），Bcl-2抗體（三鷹，批號：60178-1-Ig），Bax抗體(三鷹，批號：50599-2-Ig)，HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗（Servicebio，批號：G23303），組化試劑盒DAB顯色劑（Servicebio，批號：G1211）。

1.4 儀器：Buchi R-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI實驗室儀器公司）；Centrifuge 5810R低溫離心機（Eppendorf公司）；3111型 CO2培養(yǎng)箱（Thermo公司）；CK40-F200型倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；xCELLigence RTCA DP多功能實時無標(biāo)記細(xì)胞分析儀［艾森生物（杭州）有限公司］；TC-20細(xì)胞計數(shù)儀（Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 樣品的制備：取白藤梨根經(jīng)烘箱65℃烘干，高速粉碎機粉碎過篩，得到白藤梨根粉末。稱取1000g白藤梨根粉末，用5倍量的石油醚浸泡30min，超聲提取3次，每次30min，收集提取液，過濾，合并濾液，減壓濃縮，得到石油醚浸膏；將藥渣揮干溶劑，加5倍量乙酸乙酯浸泡過夜，倒入滲漉裝置中，用10倍乙酸乙酯滲漉提取，滲漉速度為2ml/min，收集滲漉液，過濾，合并濾液，減壓濃縮得到乙酸乙酯浸膏；將藥渣揮干溶劑，用5倍量的95%乙醇浸泡過夜，10倍量的95%乙醇滲漉提取，滲漉速度為2ml/min，收集滲漉液，過濾，合并濾液，減壓濃縮得到乙醇浸膏。將藥渣揮干溶劑，按料液比1:30的水回流提取，提取2次，每次2h，收集提取液，過濾，水浴蒸干，得到水提物。

2.2 白藤梨根體外抗A549細(xì)胞增殖的影響：分述如下。

2.2.1 樣品的配制：精密稱取“2.1”提取得到白藤梨根石油醚、乙酸乙酯和乙醇提取物浸膏，用培養(yǎng)基配制成50mg/ml和100mg/ml溶液（含0.2%DMSO），水提物用PBS緩沖液配制成50mg/ml和100mg/ml溶液，4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 RTCA DP實時細(xì)胞分析系統(tǒng)檢測提取物對A549細(xì)胞活性的影響：取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞（5×104），用胰酶消化后接種于E-Plate板上，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，記錄細(xì)胞指數(shù)（CI）。24h后加藥，設(shè)正常對照組、0.2%DMSO對照組、石油醚、乙酸乙酯、乙醇和水提物分別為（100、50μg/ml），每組設(shè)3復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)72h，記錄CI值。

2.3 白藤梨根對裸鼠移植瘤S180肉瘤的抑制作用：分述如下。

2.3.1 S180荷瘤裸鼠動物模型的建立[4]：傳代培養(yǎng)S180肉瘤細(xì)胞，收集生長期細(xì)胞，以無菌生理鹽水調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107/ml，取40只裸鼠，每只裸鼠右腋下接種0.2ml。

2.3.2 動物分組與給藥：于接種后第2天稱取裸鼠體重，隨機分為5組，每組8只，分別為模型（A）組、環(huán)磷酰胺（B）組（50mg/kg）、乙酸乙酯提取物（C）組（0.5g/kg），乙醇提取物（D）組（2.5g/kg）和水提物（E）組（3.0g/kg），每組8只。各組裸鼠于分組后開始按0.02ml/g灌胃給藥，環(huán)磷酰胺組按腹腔注射50mg/kg隔日給藥。

2.3.3 檢測指標(biāo)：每日稱重并觀察裸鼠腫瘤生長情況，末次給藥24h后，用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的最大徑及最小徑，計算腫瘤體積。頸椎脫臼處死荷瘤小鼠，取出腫瘤組織、胸腺及脾臟，稱瘤重及臟器重量，并計算抑瘤率及臟器指數(shù)。腫瘤體積=1/2×a×b2（a：腫瘤最大徑，b：最小徑）。抑瘤率=（1-T/C）×100%（T：給藥組平均瘤重，C：模型組的平均瘤重）。

2.3.4 免疫組化染色：取瘤體稱重后，4%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，脫蠟，光鏡觀察和水化，加入3%H2O2處理10min以滅活內(nèi)源性酶，PBS洗滌3次，每次5min，每張切片分別滴加Bcl-2，Bax抗體，于4℃孵育，按試劑盒操作，DAB顯色，封片，光鏡觀察。結(jié)果判定：以胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)記錄平均光密度值（AO），作為蛋白表達(dá)的量化指標(biāo)。

3 結(jié)果

3.1 白藤梨根提取物對A549細(xì)胞活性的影響：由表1可見，與正常對照組和0.2%DMSO對照組相比，石油醚、乙酸乙酯、乙醇提取物給藥濃度為100μg/ml時對A549細(xì)胞均有較好的抑制作用（P＜0.05，P＜0.01），其中乙酸乙酯提取物的抑制作用最為明顯。因此選擇乙酸乙酯提取物進(jìn)行CI值檢測，結(jié)果見表2，乙酸乙酯提取物對A549細(xì)胞有較好的抑制作用，經(jīng)計算乙酸乙酯提取物對A549細(xì)胞48h的IC50為0.39mg/ml。

表1 RTCA DP實時細(xì)胞分析系統(tǒng)檢測4種提取物對A549細(xì)胞活性的影響（±s）

表1 RTCA DP實時細(xì)胞分析系統(tǒng)檢測4種提取物對A549細(xì)胞活性的影響（±s）

注 ：與 正 常 對 照 組 比 較 ，*P＜0.05，**P＜0.01；與0.2%DMSO對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

48hCI 6.351±0.301 6.096±0.177 2.362±0.065**##5.933±0.064 0.115±0.033**##5.401±0.049 3.075±0.042*##5.545±0.078 5.951±0.067 6.994±0.127#組別正常對照組0.2%DMSO對照組100μg/ml石油醚組50μg/ml石油醚組100μg/ml乙酸乙酯組50μg/ml乙酸乙酯組100μg/ml乙醇組50μg/ml乙醇組100μg/ml水提取組50μg/ml水提物組n 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 24hCI 4.478±0.065 4.275±0.174 1.847±0.053**##3.748±0.122*0.188±0.064**##3.906±0.034**2.264±0.093**##4.135±0.066*4.333±0.105 5.311±0.094**#

表2 乙酸乙酯提取物對A549細(xì)胞活性的影響（±s）

表2 乙酸乙酯提取物對A549細(xì)胞活性的影響（±s）

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與0.2%DMSO對照組比較，##P＜0.01。

48hCI 3.544±0.118 3.674±0.035 0.194±0.011**##0.084±0.028**##2.056±0.070**##2.725±0.096**##2.762±0.098**##2.322±0.104**##組別正常對照組0.2%DMSO對照組200μg/ml組100μg/ml組50μg/ml組25μg/ml組12.5μg/ml組6.25μg/ml組n 3 3 3 3 3 3 3 3 24hCI 2.154±0.079 2.092±0.069 0.245±0.011**##0.116±0.010**##1.290±0.021**##1.702±0.035**##1.626±0.059**##1.458±0.073**##

3.2 白藤梨根提取物對S180荷瘤裸鼠的影響：分述如下。

3.2.1 白藤梨根對S180荷瘤裸鼠瘤體積、重量及對S180荷瘤小鼠臟器指數(shù)的影響：表3結(jié)果表明，與模型對照組相比較，環(huán)磷酰胺組和乙酸乙酯提取物組均能顯著抑制S180肉瘤體積的增長（P＜0.01），環(huán)磷酰胺組、乙酸乙酯組和乙醇組能顯著降低S180肉瘤的重量（P＜0.01，P＜0.05）。白藤梨根不同提取物對胸腺指數(shù)與模型組相比無顯著性差異，但是水提物組有明顯的升高趨勢；白藤梨根乙酸乙酯組和乙醇組與模型組相比，脾臟指數(shù)有明顯的抑制作用（P＜0.01），而水提物組對脾臟指數(shù)并沒有顯著性差異。

3.2.2 白藤梨根對Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響：結(jié)果如表4所示，與模型對照組比較，環(huán)磷酰胺給藥組能明顯降低腫瘤中Bcl-2蛋白的表達(dá)（P＜0.05），且能明顯增強Bax蛋白的表達(dá)（P＜0.01）；白藤梨根不同提取物對Bcl-2蛋白的表達(dá)均有一定程度降低，其中乙酸乙酯給藥組和水提物組對Bcl-2蛋白的表達(dá)有明顯的抑制作用（P＜0.05）；白藤梨根不同提取物對Bax蛋白的表達(dá)均有一定程度升高，其中乙酸乙酯提取物能明顯促進(jìn)Bax蛋白的的表達(dá)（P＜0.01）；與模型對照組相比較，白藤梨根不同提取物對Bax/Bcl-2的比率均有一定程度的升高，其中乙酸乙酯提取物組對Bax/Bcl-2有明顯的升高作用（P＜0.05）。

表3 白藤梨根不同提取物對S180實體瘤的抑制作用及對臟器指數(shù)的影響（±s）

表3 白藤梨根不同提取物對S180實體瘤的抑制作用及對臟器指數(shù)的影響（±s）

注：與A組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與B組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別A組B組C組D組E組劑量—50mg/kg 0.5g/kg 2.5g/kg 3.0g/kg給藥前體重（g）17.2±1.1 17.1±1.0 17.0±1.2 17.1±1.3 17.1±1.7給藥后體重（g）16.7±1.5 14.8±0.8**15.3±1.5*15.6±1.5 16.4±2.3腫瘤體積（mm3）1714±448 576±330**1110±309**1414±288 1544±553腫瘤重量（g）1.99±0.49 0.49±0.24**1.38±0.29**1.57±0.24*1.75±0.31抑瘤率（%）—75.59 30.80 20.93 12.18胸腺指數(shù)(mg/g)0.78±0.20##0.25±0.11**0.74±0.36##0.64±0.33#0.95±0.39##脾臟指數(shù)（mg/g）5.23±1.79##2.58±0.35**2.98±1.13**2.77±1.12**4.02±2.15

表4 白藤梨根不同提取物對Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)情況的影響（±s）

表4 白藤梨根不同提取物對Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)情況的影響（±s）

注：與A組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

分組A組B組C組D組E組Bcl-2 0.016±0.014 0.0066±0.0053*0.00658±0.0033*0.0078±0.0066 0.0062±0.0025*Bax 0.0090±0.0095 0.041±0.024**0.022±0.011**0.019±0.014 0.0080±0.0033 Bax/Bcl-2 1.12±1.71 5.94±4.61*3.72±2.94*2.53±2.97 1.41±0.46

4 討論

白藤梨根性寒、味苦澀，《中藥大辭典》中記載具有“清熱、利濕、活血、消腫、解毒”等功效。在《全國中草藥匯編》中記載白藤梨根能治療胃癌、乳腺癌、食管癌等疾病。白藤梨根是畬族民間習(xí)用藥材，也是浙中西部地區(qū)的常用藥材，其抗消化道腫瘤方面已有不少報道[5]。中藥中的化學(xué)成分復(fù)雜，其有效作用成分并不明確，因此去粗存精，去除中藥中多余雜質(zhì)，闡明中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)是中藥現(xiàn)代化的研究方向之一。

研究發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞凋亡異常密切相關(guān)，因此誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡成為評估抗腫瘤藥物療效的一項新指標(biāo)。Bcl-2和Bax是近年來研究發(fā)現(xiàn)與腫瘤細(xì)胞凋亡明確相關(guān)的基因[6]。Bcl-2基因能使細(xì)胞長期存活，抑制細(xì)胞凋亡，而Bax基因功能則剛好相反，主要促進(jìn)細(xì)胞凋亡。研究表明，Bax和Bcl-2調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡不僅取決于自身表達(dá)的高低，還與Bax/Bcl-2的比率有關(guān)，當(dāng)比率大時，細(xì)胞趨于凋亡[7-8]。本次實驗研究發(fā)現(xiàn)，白藤梨根乙酸乙酯提取物中促凋亡基因Bax蛋白表達(dá)量升高（P＜0.01），抑凋亡基因Bcl-2蛋白表達(dá)量降低(P＜0.05)，且Bax/Bcl-2比值升高(P＜0.05)。研究結(jié)果證實，白藤梨根乙酸乙酯提取物具有較好的體內(nèi)外抗腫瘤活性，其抗腫瘤作用主要通過降低Bcl-2蛋白的表達(dá)，升高Bax蛋白的表達(dá)，使Bax/Bcl-2比率升高，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。