種子類藥材菟絲子提取工藝研究

夏宇成，張蘭，陳宇潔，鞠建明，史艷玲

種子類藥材菟絲子為旋花科植物菟絲子(CuscutachinensisLam.)或南方菟絲子(CuscutaaustralisR.Br.)的干燥成熟種子，具有補益肝腎、固精縮尿、安胎、明目、止瀉的功效[1]309。菟絲子作為臨床上一種常用的中藥，最早記載于《神農本草經》，在我國產地分布廣泛，主產于山東、河北、山西、陜西、江蘇、黑龍江、吉林、新疆等地，其化學成分主要包括黃酮類、多糖類、生物堿類、萜類、甾體類、揮發油以及木質素等化合物[2]，其中金絲桃苷、槲皮素、紫云英甙等黃酮類成分為其主要活性成分[3-4]。

圖1 金絲桃苷高效液相色譜圖：A為金絲桃苷對照品；B為供試樣品

菟絲子粒度細小，在實際煎煮過程中通常采用包煎的方式。但是課題組在研究其提取方法的時候發現該藥材包煎或不包煎，水提或醇提其主要活性成分金絲桃苷提取率均較低。分析原因，推測可能因為菟絲子種皮致密，提取溶劑不易滲透進入種子內部，有效成分難以提取出來。文獻報道菟絲子的提取方法有響應面法提取多糖[5]，正交試驗酶法提取金絲桃苷[6]，正交試驗提取總黃酮[7]等方法，但均沒有考慮菟絲子種皮致密，溶劑不易穿透進入的因素。鑒于王不留行、萊菔子等質地類似的種子類藥材需要炒至爆開白花或炒至鼓起，用時搗碎的處理方法[1]53，272，本實驗擬以金絲桃苷為評價指標，采用單因素平行比較法對菟絲子提取前處理方法進行研究，確定搗碎是否有利于活性成分溶出，并對提取方式(包煎與否)和溶劑類型(水或乙醇)進行比較研究；以正交設計法對溶劑濃度、溶劑倍數、提取次數、提取時間進行優選，確定最適宜工藝參數。

本研究起止時間為2016年6月至2017年6月。

1 儀器與材料

Waters 2695高效液相色譜儀，美國Waters公司；Milli-Q純水儀，美國Millipore公司；Mettler AT210十萬分之一電子天平，瑞士METTLER公司；Legend Micro 21R離心機，賽默飛世爾科技；電熱恒溫水浴鍋，江蘇省醫療器械廠；IKA RV 10旋轉蒸發儀，德國IKA公司；KQ-250E超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司。

甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑為分析純。金絲桃苷對照品(批號111521-201004)，購自中國食品藥品檢定研究院。

菟絲子藥材(批號130501)，購自安徽豐原銅陵中藥飲片有限公司，產地內蒙古，經江蘇省中醫藥研究院錢士輝研究員鑒定為旋花科植物南方菟絲子CuscutaaustralisR.Br.的干燥成熟種子。

2 方法與結果

2.1含量測定方法建立

2.1.1色譜條件[8]色譜柱Alltima C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相乙腈-0.1%磷酸水溶液(15∶85)；流速1 mL/min；檢測波長360 nm；柱溫35 ℃。此條件下金絲桃苷與雜質峰分離度大于1.5，分離良好，如圖1。

2.1.2對照品儲備液的制備 精密稱取金絲桃苷對照品7.2 mg，置于25 mL容量瓶中，加80%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含0.288 mg的對照品儲備液。

2.1.3供試品溶液的制備 精密量提取液15 mL，置圓底燒瓶中，減壓旋轉蒸干溶劑，精密加入20 mL 80%乙醇，密塞，超聲使充分溶解，離心，取上清液過0.45 μm的微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.1.4線性范圍考察 取對照品儲備液5 mL，置10 mL容量瓶中，加入80%乙醇稀釋至刻度，依次稀釋成濃度為0.144，0.096，0.072，0.048，0.024，0.012 mg/mL的對照品溶液，依次吸取系列濃度對照品溶液20 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積。以進樣量(μg)為橫坐標(X)，峰面積積分值為縱坐標(Y)，進行回歸分析，求得金絲桃苷回歸方程為：Y=3.34×106X-1.70×105(r=0.999 9)，結果表明金絲桃苷在0.24～2.88 μg范圍內線性關系良好。

2.1.5精密度試驗 精密吸取濃度為0.096 mg/mL的對照品溶液20 μL，連續進樣6次，金絲桃苷峰面積的RSD(相對標準差)為1.1%，表明儀器精密度良好。

2.1.6重復性試驗 同一樣品液按照2.1.3供試品制備方法制備6份供試品溶液，取20 μL注入液相色譜儀，計算得到金絲桃苷含量為0.044 mg/mL，RSD為2.8%。

2.1.7穩定性試驗 精密吸取供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，10 h進樣測定，結果表明供試品溶液在10 h內穩定，金絲桃苷含量的RSD為1.5%。

2.1.8加樣回收率試驗 精密量取已知含量的樣品液7.5 mL，共6份，分別加入一定量的金絲桃苷對照品，按照2.1.3供試品制備方法制備供試品溶液，依法測定，結果回收率分別為98.0%，101.6%，99.9%，98.8%，101.3%，100.5%，平均加樣回收率為100.0%，RSD為0.7%。

2.2單因素試驗考察菟絲子提取工藝根據預實驗，對影響菟絲子提取的主要因素提取前處理方法(搗碎與否)、提取方式(包煎與否)和提取溶劑類型(水或乙醇)分別進行單因素比較，以確定適宜的提取工藝。

取菟絲子藥材20 g，精密稱定，按照表1各項加10倍量溶劑，加熱回流提取2次，每次1 h，抽濾，合并提取液，定容至500 mL，得提取液1～6號，按照2.1建立的方法測定金絲桃苷含量，結果見表1。

表1 單因素考察菟絲子提取方法

由表1可知，在藥材不搗碎的情況下，水提包煎金絲桃苷提取量比不包煎低38.0%，80%乙醇提包煎金絲桃苷提取量比不包煎低32.5%，包煎不利于有效成分的溶出，水提較醇提有利于有效成分的溶出；在藥材搗碎的情況下，不包煎醇提效果明顯優于不包煎水提，而且不包煎醇提在所有平行比較實驗中金絲桃苷提取量最高。綜合上述結果，筆者認為菟絲子采用搗碎后不包煎醇提的方法有利于有效成分的提取。

2.3正交試驗優選菟絲子提取工藝參數

2.3.1正交試驗供試品制備及測定 根據表1及平行實驗確定的提取條件，對影響提取工藝的主要因素(A乙醇濃度、B溶劑體積、C提取時間、D提取次數)按4因素3水平進行L9(34)正交試驗[9]。各因素水平安排見表2。將菟絲子藥材搗碎，取20 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，分別按正交試驗表中所列條件進行實驗，平行2份，提取液抽濾，合并，根據實際得到的體積，適當稀釋或濃縮，最終統一定容至500 mL，按照2.1建立的方法測定金絲桃苷含量，結果見表3。

表2 菟絲子提取正交試驗因素水平

2.3.2正交實驗結果 對正交試驗樣品含量測定結果，采用SPSS 18.0統計軟件進行直觀分析及方差分析，結果見表3,4。

表3 菟絲子提取正交試驗安排及直觀分析

注：ki表示任意列上水平號為i時所對應的試驗結果之和；R為極差

表4 綜合評分方差分析

注：F0.05(2，2)=19，F0.01(2，2)=99，f均為2

由直觀分析可知，極差最大的為A因素，影響因素排序為A>D>C>B。說明對金絲桃苷含量影響最大的為乙醇濃度，其次為提取次數、提取時間、溶劑倍數，最優提取工藝參數為A1D3C2B2；以B為誤差項對提取結果進行方差分析，結果A差異有統計學意義，C、D差異無統計學意義，從節約能源，提高生產效率角度考慮，綜合直觀分析和方差分析結果，確定最佳提取工藝為A1D2C2B2，即10倍量55%乙醇，提取2次，每次1 h。

2.3.3驗證實驗 按優選的最佳提取工藝進行試驗，測定提取液中金絲桃苷含量，結果見表5。

表5 工藝驗證實驗(n=3)/%

由表5可見，確定的提取工藝金絲桃苷的平均含量為0.204%，RSD為1.7%，說明工藝重復性好，穩定可行。

3 討論

種子類藥材由于其種皮致密，傳統一般將其搗碎或炒至爆開白花，使溶劑能進入種子內部，有利于有效成分的溶出，然而菟絲子在臨床使用時一般用生品，未經任何處理。本研究首次對菟絲子提取方法進行了較系統的研究，發現菟絲子不搗碎時，不論是水提還是醇提，不包煎比包煎更有利于有效成分的溶出，可能是因為不包煎菟絲子藥材分散在溶劑中，能充分接觸溶劑，而且在提取的過程中，菟絲子在微沸的溶劑中滾動，起到攪拌的作用；根據菟絲子中活性成分金絲桃苷的理化性質，醇提效果應該優于水提，然而在不搗碎時，醇提效果不如水提，可能是因為乙醇的滲透性不如水，難以進入菟絲子種子內部，有效成分不利于提取出來，一旦菟絲子被搗碎破壁，乙醇就容易進入其內部，根據相似相溶原理，其醇提效果就優于水提。總之，本研究認為菟絲子適宜的提取方法為先搗碎，然后采用乙醇提取，不宜包煎。該結論為同類種子類藥材的提取提供了較好的參考價值。

一般認為，種子類藥材不包煎不利于提取液過濾，藥材搗碎破壁更加增加過濾的難度。但是我們對含菟絲子的臨床復方單副藥進行煎煮，用100目濾網過濾，由于藥量較少，濾過比較容易，藥渣也能較好地濾除；工業生產中，隨著制藥設備的進步，大量的藥液可以通過加壓使得提取液快速濾過，因此無論是臨床湯劑的單劑量煎煮，還是工業大生產，種子類藥材搗碎破壁不包煎都是可行的。

本研究在確定提取方法后，采用正交試驗法對醇提工藝參數進一步優化，確定了最適宜提取溶劑濃度、溶劑用量、提取時間和提取次數，在此基礎上進行了驗證實驗，確定制定的工藝重復性好，活性成分提取率高，適用于菟絲子的提取。