有氧運動改善老年腦小血管病大鼠淡漠行為機制的研究

老年人的腦血管疾病是血管性認知障礙最常見的原因之一,最近的研究顯示，淡漠是老年腦小血管病(cerebral small vessel disease,CSVD)的主要神經精神癥狀,且存在于伴有白質病變的病人中。淡漠是一種由情感遲鈍、認知和行為減退組成的綜合征,通常被認為是認知衰退的一種形式[1]。在大、小鼠中挖穴技能受損及社交能力下降,均被認為是動物的淡漠行為[2-3]。髓鞘是由中樞神經系統少突膠質細胞軸突周圍形成的絕緣鞘,在認知功能的發育和維持中起重要作用,炎癥和髓鞘損傷可能引起神經精神癥狀[4]。髓鞘主要分布于白質,接受不成比例的低血流供應和少量的側支循環,因此,白質特別容易受到缺血性損傷,這種類型的損傷是血管性認知損害的重要特征[5]。各種人類和動物研究表明,體育鍛煉可以改善認知功能,但其機制仍不清楚[6]。本研究主要探討有氧運動是否可以改善小鼠缺血性損傷導致的淡漠行為,為有氧運動改善臨床CSVD病人淡漠行為提供根據。

1 材料與方法

1.1 動物模型建立及分組 雄性成年300～350 g的SD大鼠(北京斯貝福實驗動物科技有限公司)48只,隨機分為4組,每組12只。正常對照組不做任何處理;假手術組僅暴露雙側頸動脈,不進行結扎,在4周后進行4周的游泳鍛煉;腦缺血組和游泳組采用雙側頸動脈結扎法(bilateral common carotid artery occlusion,BCCAO)制備大鼠CSVD模型,游泳組在BCCAO術后4周進行4周的游泳鍛煉。實驗共8周。術前對所有大鼠進行挖穴和社交評價,假手術組和游泳組大鼠于直徑80 cm、高90 cm的圓柱形水桶中,1次/d,每次1 h,每周5次,進行為期4周的游泳鍛煉。術前和術后8周對4組大鼠進行挖穴和社交評價;之后每組6只用于固藍染色和免疫熒光染色檢測離子鈣接頭蛋白分子(Iba-1)、膠質纖維酸性蛋白(GFAP)陽性星形膠質細胞數目;6只用于Western blotting試驗。

1.2 挖穴和社交評估 挖穴的測定參照文獻[7]:利用長32 cm,直徑為10 cm的塑料水管,一端用纖維板密封,用2個角度為90度的螺絲將管的一端遠離地板6 cm高。將塑料水管內填充2500 g沙礫,下午16時開始測試,2 h后將洞穴內剩余的食物稱重進行基線測定,然后重新放回籠中,過夜后于次日早晨8時再次進行剩余沙礫的測定。社交行為的測定參照文獻[8]:使用一個透明的有機玻璃籠子,大小為46 cm(長)×21.5 cm(寬)×20.5 cm(高),含有1 cm厚的木屑墊料。由21.5 cm×20.5 cm的內壁分成2個相同大小的隔室。內壁的中間底部有一個絲網孔(直徑7.6 cm),被2個交叉鐵絲線劃分成4個相等大小的塊,可讓受試大鼠進行嗅探,但可防止與隔間正常大鼠的直接接觸。受試大鼠和正常大鼠被放置在隔室中10 min。在沒有實驗者的情況下,在昏暗的房間里進行測試。對動物的行為進行視頻記錄并評估。嗅探:動物將其鼻子伸入絲網孔并隨其晶須移動的持續時間;穿越:動物在測試室中穿過絲網孔的次數。

1.3 髓鞘損傷評估 實驗大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉,灌流固定,取大鼠基底節區腦組織行常規冰凍切片,厚度為10μm,將切片浸于固藍染色液中4 h,70%乙醇,碳酸鋰分化之后,梯度酒精脫水、二甲苯透明,中性樹膠封片,鏡下觀察大鼠白質束髓鞘損傷情況。

1.4 免疫熒光檢測 取冰凍切片通過高溫熱修復法進行抗原修復,常規畫圈,滴加打孔液,10%山羊血清封閉2 h后,加入1∶100稀釋的一抗Iba-1(Abcam公司,英國)和1∶250稀釋的一抗GFAP(Abcam公司,英國)后：4 ℃過夜,PBS沖洗,滴加辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗(碧云天,中國)2 h,PBS沖洗,DAPI染劑15 min復染,10%甘油封片,熒光顯微鏡下觀察。

1.5 western blotting法檢測 取大鼠基底節區腦組織用PIPA裂解液勻漿后,12000 r/min4 ℃離心15 min后取上清,加4x蛋白上樣緩沖液后,用BCA試劑盒測定蛋白濃度,常規western blotting法檢測髓鞘堿性蛋白(MBP)、白細胞介素1(IL-1)、IL-6及腫瘤壞死因子(TNF-α)的蛋白表達水平,以GAPDH為內參組。采用Image J軟件計算目的條帶灰度值,各組與對照組的百分比用于統計分析。

2 結果

2.1 有氧運動對大鼠挖穴和社交能力的影響 與正常對照組和假手術組相比,腦缺血組大鼠術后4周出現明顯的挖穴和社交能力下降(P<0.05)。與腦缺血組大鼠相比,游泳組大鼠挖穴剩余沙礫的質量減少,嗅探時間和穿越次數增加,二者均得到一定的改善(P<0.05)。見表1。

表1 各組間挖穴和社交行為的比較

注:與正常對照組與假手術組比較,*P<0.05;與腦缺血組比較,△P<0.05

2.2 有氧運動對大鼠髓鞘再生的影響 Fast blue染色結果顯示,與正常對照組和假手術組相比,BCCAO后4周,腦缺血組的胼胝體和尾狀核部位出現髓鞘損傷(包括髓鞘纖維紊亂,空泡形成或髓鞘丟失)。相對于腦缺血組,游泳組髓鞘損傷顯著減少。見圖1。

2.3 有氧運動對小膠質細胞活化的影響 在假手術組中,大多數小膠質細胞處于靜息狀態,體育鍛煉對假手術大鼠的表型變化沒有顯著影響。與正常對照組和假手術組相比,腦缺血組中富含更多的Iba-1、GFAP細胞(P<0.05)。此外,相對于腦缺血組,游泳組下調Iba-1、GFAP陽性小膠質細胞的數量(P<0.05)。見表2,圖2,3。

圖1 有氧運動對CSVD大鼠髓鞘再生的影響(n=6)

組別Iba-1+/mm2GFAP+/mm2MBPIL-1IL-6TNF-α正常對照組13.66±1.9623.83±1.600.56±0.020.54±0.030.58±0.010.57±0.01假手術組14.66±1.0322.83±1.600.57±0.040.56±0.020.57±0.020.56±0.05腦缺血組33.16±1.94?50.16±5.11?0.37±0.02?0.75±0.02?1.07±0.04?0.75±0.02?游泳組組23.16±2.31?△27.66±2.16?△0.51±0.03?△0.62±0.08?△0.74±0.04?△0.76±0.03?

注:與正常對照組和假手術組比較,*P<0.05;與腦缺血組比較,△P<0.05

圖2 有氧運動對CSVD大鼠Iba-1活化的影響(n=6)

圖3 有氧運動對CSVD大鼠GFAP活化的影響(n=6)

2.4 有氧運動對炎癥介質和髓鞘再生的影響 正常對照組和假手術組IL-1、IL-6和TNF-α很少表達,而腦缺血組IL-1、IL-6和TNF-α表達顯著增加(P<0.05),MBP表達下降(P<0.05)。體育鍛煉增加了MBP蛋白含量(P<0.05),降低了IL-1、IL-6蛋白表達水平(P<0.05),TNF-α各組間表達無明顯變化(P>0.05)。見表2，圖4。

圖4 有氧運動對CSVD大鼠MBP及炎癥介質的影響

3 討論

CSVD引起的慢性低灌注可導致少突膠質細胞的丟失和髓鞘損傷[9]。本研究結果顯示，大鼠在BCCAO后8周,LFB染色和MBP蛋白印跡的結果均證實了髓鞘損傷，體育鍛煉可改善老年CSVD大鼠的挖穴與社交能力,這是通過降低小膠質細胞的活化,降低炎癥反應介質表達,從而減少髓鞘丟失和軸突損傷。在臨床研究中發現類似的結果，體育鍛煉改善了老年CSVD病人的WM完整性[10]。此外,進行性抵抗體能訓練可逆轉癡呆前驅癥狀及輕度認知功能障礙病人的WM高信號進展并改善總體認知功能[11]。已有研究表明,小膠質細胞的活化可以對髓鞘產生破壞并降低髓鞘保護作用[12]。減少小膠質細胞活化可以驅動少突神經膠質祖細胞分化并阻止新生少突膠質細胞凋亡,這是髓鞘再生的重要機制[13]。本研究中,我們發現體育鍛煉可以減少Iba-1、GFAP陽性小膠質細胞的表達,此外,體育鍛煉通過降低促炎因子(TNF-α,IL-1,IL-6)的蛋白表達來阻止小膠質細胞的活化。與我們的研究結果一致,之前的研究也發現,跑步運動可減輕小膠質細胞的增殖,促進少突膠質細胞形成和髓鞘再生,這與運動誘導的神經發生有關[14]。

腦白質脫髓鞘是人腦退行性改變中主要觀察到的細胞變化[15]。通過減少炎癥介質的產生及小膠質細胞的活化,維持髓鞘磷脂完整性來促進學習與記憶,提高CSVD病人的生存質量,對于社會及家庭是極其重要的。本實驗亦有不足之處,檢測大鼠的淡漠行為有一定的局限性,下一步本課題組將嘗試在臨床上評估老年CSVD病人的淡漠行為,并進行有氧運動的測試,進一步證實本實驗的研究結果。