采用飽和突變提高谷氨酰胺酶的熱穩定性

陳笑，李江華*，劉松，堵國成

1(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122) 2(工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)

谷氨酰胺酶(glutaminase，EC 3. 5. 1. 2)廣泛存在于細菌、酵母菌、真菌等微生物中，是生物體氮代謝過程中的關鍵酶，被廣泛應用于食品、醫療等多個領域[1-2]。某些微生物來源的谷氨酰胺酶可以催化谷氨酰胺的γ-谷氨酰基轉移反應，制備一種功能性食品添加劑——茶氨酸，比如硝基還原假單胞菌(Pseudomonasnitroreducens)[3]。在醬油釀造業中，利用L-谷氨酰胺酶水解谷氨酰胺生成具有鮮味的氨基酸——谷氨酸，醬油曲料中的谷氨酰胺酶的酶活力是影響醬油發酵中L-谷氨酸得率的關鍵因素[4]。WAKAYAMA等[5]將來自嗜麥芽寡養單胞菌(StenotrophomonasmaltophiliaNYW-81)的谷氨酰胺酶純化至均一，該酶比酶活為325 U/mg，具有較高的耐鹽性和熱穩定性。在添加S.maltophilia谷氨酰胺酶的模型反應中，谷氨酸的濃度是添加米曲霉(Aspergillusoryzae)谷氨酰胺酶的4倍，是添加藤黃微球菌(MicrococcusluteusK-3)谷氨酰胺酶的2.6倍，該酶顯示出較高的谷氨酸生產能力。此外，谷氨酰胺酶能特異性水解植物蛋白中谷氨酰胺殘基的胺酰基，提高蛋白質的功能性質[6]。

目前大部分谷氨酰胺酶熱穩定性較低，限制了其在醬油釀造等高溫環境中的應用[7]。為提高谷氨酰胺酶的應用效果，人們開始重視它的穩定性研究。DURA等[8]研究發現，添加乙二胺四乙酸和乙二醇可使德巴利酵母屬(Debaryomycesspp. CECT 11815)谷氨酰胺酶的半衰期(t1/2，25 ℃)分別提高29%和43%。MATSUURA等[9]將大腸桿菌(Escherichiacoli)谷氨酰胺酶封裝于Santa Barbara Amorphous(SBA)顆粒中形成酶-SBA10.6 復合物，其60 ℃下熱穩定性較固定化前提高3.3倍。盡管相關研究一定程度上提高了谷氨酰胺酶的熱穩定性，但僅局限于酶穩定劑篩選及固定化，缺乏對酶分子自身穩定性的改造。

隨著生物信息學的發展，部分軟件可以利用蛋白質結構計算氨基酸突變能(如Discovery Studio[10-11]等)，預測影響蛋白穩定性的關鍵氨基酸。李廣林等[12]通過設計點突變和二硫鍵位置的策略，構建篩選庫(36個單點突變體)提高脂肪酶熱穩定性。最穩定的突變體Tm值提高14.3 ℃，半衰期(t1/2，70 ℃)提高12.5倍，催化效率提高39%。合理的計算方法能減少篩選突變克隆的數量，減少工作量，高效篩選出優良突變株。最近的研究表明，蛋白質中排斥靜電相互作用會破壞蛋白質的穩定性。KOIDE等[13]發現人纖連蛋白(FNfn10)的第10個纖連蛋白III型結構域在酸性環境中比中性環境中穩定，其中Asp23、Glu9和Asp7在FNfn10表面形成帶負電的斑塊，表明在中性環境中存在排斥的靜電相互作用。突變體D7N和D7K表現出適應性且穩定性不再依賴pH，推測減少蛋白中不利相互作用有利于提高蛋白穩定性。鄭鵬[14]為評估靜電相互作用對小蛋白GB1的機械穩定性的影響，將雙組氨酸基設計到GB1的受力區域中，改變pH值His可以在質子化和去質子化之間切換，在酸性條件下兩個帶正電荷His靜電排斥作用強，GB1機械穩定性降低34%。因此可以通過優化蛋白質靜電相互作用的方法提高蛋白穩定性。

本研究以枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis168)的谷氨酰胺酶(YbgJ)為研究對象，利用DS 2017(BIOVIA，美國)對酶分子中具有不利相互作用的49個氨基酸進行虛擬突變，確定了影響酶熱穩定性的關鍵氨基酸位點進行飽和突變，獲得熱穩定提高的突變體。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株與質粒：表達質粒pP43NMK、大腸桿菌(EscherichiacoliJM109)及宿主枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisWB600)，來源于本實驗室前期構建保存。質粒pP43NMK-YbgJ為作者實驗前期構建。

種子培養基(LB，g/L)：酵母粉5，胰蛋白胨10，NaCl 10。

發酵培養基(TB，g/L)：酵母粉24，胰蛋白胨12，甘油4，K2HPO416.43，KH2PO42.31，調節pH至7.0，于121 ℃，0. 08 MPa下滅菌20 min。

固體培養基是在液體培養基中加2%的瓊脂。

重組大腸桿菌用LB培養基(含100 μg/mL氨芐霉素)進行培養和篩選；重組枯草芽孢桿菌用LB培養基(含80 μg/mL卡納霉素)進行培養和篩選

酶、試劑、引物和DNA序列測定：限制性核酸內切酶購自Thermo Fisher Scientific公司，膠回收試劑盒和Competent Cell Preparation Kit試劑盒購自Takara(大連)公司，Bradford蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天公司。引物合成和DNA測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 軟件分析

利用DS對YbgJ(PDB，1mki)分子中具有不利相互作用的49個氨基酸位點進行虛擬突變，計算出突變體與野生型的結合自由能差值[ΔΔGmut=ΔGbind(mut)-ΔGbind(WT)]。根據能量值高低對突變體排序，選擇前3個氨基酸位點E3、E55、D213進行飽和突變實驗。利用在線服務器SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/)，以YbgJ為模板構建突變體的模擬結構。

1.2.2 YbgJ突變體的構建及表達

以pP43NMK-YbgJ質粒為模板，通過PCR引入突變氨基酸(引物如表1)。PCR循環數為15，PCR結束后利用DpnI消化模板1 h，柱回收后回收產物轉化至E.coliJM109中，在37 ℃恒溫培養箱中培養10 h。待長出明顯的單個菌落后，挑取2～3個菌落進行測序，并將測序正確的轉化子提取質粒轉入B.subtilisWB600中，得到突變菌株。挑取單個菌落至LB培養基(含100 μg/mL卡納霉素)中，于37 ℃、220 r/min搖床振蕩培養8 h。將種子液以2%的接種量轉接TB培養基，37 ℃，220 r/min搖床振蕩培養15 h。

表1 E3、 E55、 D213位點飽和突變引物Table 1 Saturation mutagenesis-primer of E3, E55 andD213 site

注： “NNK”、“MNN”中N代表A/G/C/T；K代表G/T；M代表A/C。

1.2.3 YbgJ突變體的純化

將發酵液于4 ℃，7 000 r/min條件下離心15 min后收集菌體，將菌體用buffer A (pH 7.5，20 mmol/L K2HPO4-KH2PO4緩沖液)重懸后超聲破碎30 min (工作1 s，暫停2 s)，于4 ℃，7 000 r/min條件下離心15 min即得粗酶液。將粗酶液經0.22 μm濾膜過濾后使用His TrapTMHP 5 mL(GE)進行純化。首先使用buffer A平衡預裝柱，以1 mL/min的流速上樣，上樣量15 mL。用10倍柱體積的結合緩沖液脫洗非特異性結合雜質，隨后用洗脫緩沖液(500 mmol/L咪唑，20 mmol/L K2HPO4-KH2PO4，pH 7.5) 洗脫結合蛋白，其中15%洗脫緩沖液洗脫出雜蛋白，40%洗脫緩沖液洗脫出目標蛋白。收集穿透峰、洗脫峰，利用SDS-PAGE檢測YbgJ突變體純化情況。

1.2.4 YbgJ酶活測定

采用奈氏試劑法[15-16]測定YbgJ的活力。利用buffer A配制底物(L-谷氨酰胺，1.2 g/110 mL)，取1 100 μL底物(74 mmol/L)于37 ℃保溫10 min后，加入100 μL稀釋到適當倍數的粗酶液，37 ℃反應10 min后加入100 μL終止劑(三氯乙酸，1.5 mol/L)終止反應。在37 ℃保溫10 min的1 100 μL底物中加入上述100 μL粗酶液與100 μL終止劑的混合液，于37 ℃保溫10 min，所得溶液即為吸光度檢測的對照。反應結束后12 000 r/min離心2 min，取100 μL上清，加入3 400 μL去離子水和500 μL奈氏試劑，混勻后在波長436 nm下測定吸光度。酶活力的定義：在37 ℃，pH為7.5條件下每分鐘催化L-谷氨酰胺產生1 μmol NH3所需要的酶量定義為1個酶活力單位。

1.2.5 濃度的測定

蛋白質濃度測定采用Bradford蛋白濃度測定試劑盒，具體按說明書操作。

1.2.6 酶學參數的測定

半衰期檢測(t1/2, min)：將純化后的突變YbgJ稀釋到同一濃度，放置于55 ℃水浴保溫30 min，其中每隔3 min取樣并按照1.2.4方法測定YbgJ的殘余酶活，確定半衰期。

Km和kcat測定：配制0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 mmol/L的L-谷氨酰胺溶液，按照1.2.4測定酶活力，并用MATLAB軟件擬合y=ax/(b+x)曲線，b=Km、a=Vmax，再計算得到Kcat值、Kcat/Km值。

數據分析：采用Microsoft Office Excel 2003單因素方差分析模塊對WT和突變體的酶學參數進行分析。

1.2.7 圓二色譜及穩態熒光光譜分析

采用圓二色譜儀(circular dichroism spectrum, CD)分析YbgJ以及突變體YbgJ的二級結構。將純化后的YbgJ酶液稀釋到100～120 μg/mL，樣品池光程為1 mm，分析190～250 nm遠紫外波長下的CD光譜。再運用在線預測網站(http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/home.shtml)獲得蛋白質的各類二級結構(α螺旋、β折疊等)的含量。

采用Hitatch F-7000測定YbgJ內源熒光光譜。將純化后的YbgJ及突變體用buffer A稀釋至100 μg/mL，激發波長為298 nm，發射波長為300～500 nm，間隔0.2 nm進行掃描，激發和發射狹縫寬度均為10 nm。

1.2.8 醬油發酵模擬體系的構建

醬油發酵模型系統(5 mL)由大豆蛋白分離物、NaCl、堿性蛋白酶、復合風味酶、谷氨酰胺酶組成。0.5 g大豆蛋白分離物(SPI)溶于5 mL 100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)中，加入堿性蛋白酶500 μL，60 ℃水浴2 h后加入復合風味500 μL，50 ℃繼續水浴4 h，90 ℃ 10 min終止蛋白酶的活性。4 ℃，12 000 r/min離心15 min，收集上層樣品用作生物轉化反應的底物。根據FIELDS的方法[17]利用三硝基苯磺酸(TNBS)測定α-氨基含量以檢測大豆蛋白分離物被酶解的程度，使用L-亮氨酸作為標準樣品。在上層清液中加入18% NaCl，調節pH至5。將制備得到的YbgJ及突變體純酶液添加到模型反應混合物中，45 ℃水浴保溫，在不同的時間取出反應液1 mL，90 ℃ 10 min終止酶反應。利用谷氨酸脫氫酶檢測谷氨酸的含量。

2 結果與分析

2.1 YbgJ突變位點的確定

運用Discovery Studio 2017軟件的分子對接模塊，構建YbgJ與底物L-谷氨酰胺的復合物。利用該軟件的虛擬氨基酸突變模塊，對YbgJ中具有不利相互作用的49個氨基酸進行丙氨酸掃描，基于突變能變(ΔΔGmut)分析影響該酶熱穩定性的關鍵氨基酸。一般認為，ΔΔGmut值是負值，表明突變后能量下降，酶穩定性提高；反之突變后能量上升，酶穩定性較差。根據能量值高低對突變體排序(如圖1-b)，選擇前3個氨基酸位點E3、E55、D213進行飽和突變實驗。

圖1 YbgJ三級結構部分不利相互作用位點(a)及虛擬突變體能量值(b)Fig.1 Part of the adverse interaction sites of YbgJ tertiary structure(a) and energy value of virtual mutant(b)

2.2 YbgJ突變體的構建與表達

以pP43NMK-YbgJ質粒為模板，通過PCR引入突變氨基酸。將測序正確的轉化子轉入B.subtilisWB600中，發酵表達YbgJ突變體，測胞內YbgJ的熱穩定性。前期研究中發現野生型YbgJ在55 ℃下的半衰期為10.79 min。為了能夠篩選到穩定性提高的突變體，本研究將E3、E55、D213位點所有突變體在55 ℃保溫12 min測定殘余酶活(圖2)。

M-蛋白質標準分子質量(kDa)；1～9-YbgJ、E55F、E55L、D213T、D213W、D213R、E3C、E3S、E3P純酶液圖2 pP43NMK-YbgJ質粒圖(a)及優勢突變體純化蛋白的電泳分析圖(b)Fig.2 The plasmids mapof pP43NMK-YbgJ(a) and SDS-PAGE analysis(b) of wild YbgJ and mutant enzymes

突變體E55F、D213T、E3C、E3S、E3P和E3A較WT熱穩定性明顯提高。通過Ni2+親和層析法純化得到E55F、E55L、D213T、D213W、D213R、E3C、E3S、E3P純酶液(圖2-b)，進一步分析其酶學性質。

2.3 YbgJ突變體酶學性質分析

如表2所示，突變體E3C、E3S、E3P、E55F、D213T半衰期(t1/2，55 ℃)較WT分別提高58%、42%、39%、69%和41%，這表明E3、E55、D213對YbgJ的熱穩定性有較大的影響。此外D213W、D57S和D213T的比酶活分別提高了17%、12%和11%，而突變體E55F、E55L、D213R和E3S比酶活反而降低。所有突變體的Km值與WT相比均下降，其中D213T、E55F突變體的Km值分別降低了22%、19%；突變體的催化常數(kcat)與野生型相比提高了2%～13%不等；突變體E55F、D213T、D57S的kcat/Km分別提高了37%、32%、30%。這說明E55、D213對YbgJ的底物結合能力有一定的影響。

表2 野生YbgJ和突變體的酶學性質Table 2 Enzymatic properties of WT and mutants

注：P值用于判斷突變體和WT之間酶學參數的統計學顯著性。

2.4 復合突變提高YbgJ熱穩定性

在前面研究中得到E3C、E55F、D213T三株較好的正向突變體。為了進一步驗證E3，E55，D213位點對YbgJ穩定性有重要影響，將位點E3、E55、D213進行復合突變，獲得E3C/E55F、E3C/D213T、E55F/D213T和E3C/E55F/D213T四個突變體(表3)。

如表3所示，4個復合突變體的半衰期(t1/2，55 ℃)明顯提高，E3C/E55F/D213T、E3C/E55F、E3C/D213T和E55F/D213T的半衰期與WT相比分別提高了1.73、1.44、1.22和0.97。研究表明：多個耐熱性突變位點協同作用可以進一步提高熱穩定性。對復合突變體動力學參數進行分析，發現復合突變體Km值與WT相比均下降，其中E3C/D213T下降了31%。此外E3C/E55F/D213T、E3C/E55F的Kcat值提高的幅度較大，分別提高39%和29%。4個復合突變體比酶活均有增加，其中E55F/E3C提高23%，最終為693 U/mg。

表3 野生YbgJ和復合突變體的酶學性質Table 3 Enzymatic properties of WT and mutants

注：P值用于判斷突變體和WT之間酶學參數的統計學顯著性。

2.5 YbgJ突變體的穩定化機制分析

上述研究中發現E3C/E55F/D213T 穩定性較好，為進一步分析突變體穩定性提升的原因，本研究利用圓二色譜(CD)和熒光光譜對WT及其突變體的二級、三級結構進行分析比較(圖4)。如圖4-a所示，突變體的CD圓二色譜曲線無明顯變化，說明其二級結構并未發生改變。為進一步定量WT及突變體的二級結構含量，利用在線軟件分析各二級結構的含量，結果顯示突變體與WT的二級結構含量沒有顯著區別。如圖4-b所示，熒光光譜結果顯示其最大熒光吸收峰沒有發生變化，仍為394 nm。綜合上述結果可知復合突變并未改變YbgJ的結構。

□-WT；▲-E3C/E55F/D213T圖4 野生型及其突變體圓二色譜(a)及穩態熒光光譜分析(b)Fig.4 CD spectrum(a) and steady-state fluorescence spectra analysis(b) of WT and its mutants

為深入分析YbgJ突變體穩定性提高的機理，利用DS服務器以YbgJ (1mki.PDB)為模板同源建模，構建突變體的三維結構模型，并結合在線軟件Protein Interaction calculator (http://pic.mbu.iisc.ernet.in/job.html)分析WT及突變體分子內部的相互作用力(如表4)。有研究表明，蛋白質分子的熱穩定性、催化活性與蛋白質分子間作用力的種類和數量有關，且降低蛋白表面的疏水性或者增強分子內部的疏水性有利于蛋白質的穩定。PACE等[18]為了更好地了解蛋白質分子間相互作用對蛋白質穩定性的貢獻，測定了四種蛋白突變體的構象穩定性的變化，研究發現疏水相互作用對小蛋白穩定性的貢獻小于大蛋白質；折疊中掩埋的-CH2基團對蛋白質穩定性貢獻(1.1±0.5) kcal/mol；疏水相互作用貢獻(60±4)%，氫鍵貢獻(40±4)%；構象熵貢獻約2.4 kcal/mol/殘基，并且提出蛋白質的球狀構象主要由疏水性相互作用穩定。如表4所示，突變體E3C/E55F/D213T、E3C/E55F和E55F/D213T 的疏水相互作用力都增加。因此疏水作用力的增加極有可能是YbgJ熱穩定性提高的一個原因。

此外，突變體E3C/E55F/D213T、E3C/E55F、E3C/D213T和E55F/D213T 較WT分別增加了30、23、11和8個氫鍵。JOHN等[19]為了研究來自極端嗜熱生物Thermusaquaticus的D-甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)熱穩定性的決定因素，將各種來源的GAPDH進行比較，發現熱穩定性與帶電側鏈和中性配位體間的氫鍵數量存在很強的相關性。MABROUK等[20]基于序列比對和同源建模改造了芽孢桿菌屬的麥芽糖淀粉酶，發現酶熱穩定性提高是因為形成了新的疏水相互作用、鹽橋和氫鍵，同時也提出氫鍵增加是酶分子穩定性提高的重要原因之一。因此氫鍵的增加可能是YbgJ熱穩定性提高的重要原因之一。

表4 突變前后YbgJ作用力變化Table 4 Interactions potentially involved in the stability of wild-type and mutant

運用軟件DS對YbgJ和突變體的不利相互作用數量進行統計(如表4)。突變體E3C/E55F/D213T、E3C/E55F、E3C/D213T和E55F/D213T較WT分別減少了5、4、4、3不利相互作用。相關研究表明蛋白質表面相同電荷之間的排斥相互作用會使蛋白質穩定性降低[13]。由此推測，不利相互作用的減少也可能是YbgJ熱穩定性提高的原因之一。

2.6 醬油發酵模型反應中YbgJ及突變體的應用

為了驗證YbgJ及突變體的潛在應用價值，將純酶液添加到醬油發酵模型反應中檢測谷氨酸的產量。利用堿性蛋白酶和復合風味酶對大豆蛋白進行酶解，檢測酶解液中的α-氨基含量達到97～100 mmol/L，表明大豆蛋白被降解。在上層清液中加入18% NaCl，調節pH至5，模擬醬油發酵反應。將制備得到的YbgJ及突變體純酶液添加到反應混合物中，45 ℃水浴保溫。利用谷氨酸脫氫酶測不同時間谷氨酸的含量。如圖5所示，相比于添加YbgJ的醬油發酵模型體系，添加復合突變體有效地增加了谷氨酸的含量。

■-WT；▽-E55F / D213T；▲-E3C/D213T；□-E3C/E55F；△-E3C/E55F/D213T圖5 醬油發酵模型中谷氨酸的產量Fig.5 Glutamic acid production in soy sauce fermentation model

在pH為5的醬油發酵模型中，添加E3C/E55F/D213T、E3C/E55F、E3C/D213T、E55F/D213T后谷氨酸的含量分別比添加WT提高134%、86%、60%、42%。隨著反應時間的延長，谷氨酰胺酶逐漸失活，谷氨酸含量的增長逐漸減慢。比較圖中5條曲線，發現E3C/E55F/D213T在5～10 h中的谷氨酸增長斜率>E3C/E55F>E3C/D213T>E55F/D213T>WT，由此說明E3C/E55F/D213T的應用價值較大。

3 結論

本研究中通過飽和突變的方法，確定了E3、E55、D213位點是提高谷氨酰胺酶熱穩定性的重要位點，構建的突變體E3C、E55F、D213T半衰期(t1/2，55 ℃)較WT分別提高58%、69%和41%。復合突變體E3C/E55F/D213T、E3C/E55F、E3C/D213T和E55F/D213T的半衰期(t1/2，55 ℃)與WT相比分別提高了1.73、1.44、1.22和0.97，其中E3C/E55F比酶活提高23%，最終為693 U/mg。在pH為5的醬油發酵模型中，添加E3C/E55F/D213T、E3C/E55F、E3C/D213T、E55F/D213T后谷氨酸的含量分別比添加WT提高134%、86%、60%、42%。獲得的熱穩定性提高及催化活性提高的突變體YbgJ將有助于工業化應用。