葡萄抑菌附生細(xì)菌篩選鑒定及其結(jié)構(gòu)表征

馮語嫣，劉曉凡，范青，陳開業(yè)，胡伊?xí)F，辛志宏

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，江蘇 南京，210095)

葡萄含水量高，易受微生物侵染，從而產(chǎn)生多種病害。目前，化學(xué)農(nóng)藥是防治各種葡萄病害的主要措施，但頻繁使用農(nóng)藥不僅破壞生態(tài)環(huán)境，而且威脅消費(fèi)者的食用安全。因此，尋找安全、高效和無污染的替代措施將成為科學(xué)工作者面臨的重要研究課題。

生物防治(biological control)是利用各種有益生物或其產(chǎn)生的活性物質(zhì)及分泌物,控制病、蟲、草群體的增殖,從而達(dá)到降低甚至消滅病蟲草害的目的。這類方法能夠保持生態(tài)平衡，無污染、不產(chǎn)生抗性，從而保證了人畜安全，避免了化學(xué)農(nóng)藥防治帶來的弊病，在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中日益受到重視。

植物附生菌(epiphyte)附著在植物根、莖、葉、果表面，通過一定方式與植物相互作用[1]。研究表明，多數(shù)植物或果實(shí)表面有大量的附生微生物，這些微生物可以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)各異、生物活性多樣的次級(jí)代謝產(chǎn)物[2]。如劉麗等[3]通過傳統(tǒng)培養(yǎng)結(jié)合分子生物學(xué)的方法，分離鑒定普洱古茶樹表皮附著多種微生物，如芽孢屬、青霉屬等，其中Bacilluspumilus對(duì)大部分葉圍微生物有不同程度的拮抗作用，產(chǎn)黃青霉菌(Peaicilliumchrysogenum)能產(chǎn)生青霉素，能抑制多種微生物的生長。因此，從各種植物中分離鑒定附生菌，深入研究其生物活性，對(duì)于防治各種農(nóng)業(yè)病蟲害和發(fā)現(xiàn)新型殺蟲劑具有重要作用。

夏黑葡萄屬于歐美雜交品種，具有抗逆性強(qiáng)、適用范圍廣的特點(diǎn)，在早熟品種中綜合性狀優(yōu)異，已成為我國主要的鮮食葡萄種類之一[4]。研究表明，夏黑葡萄的表皮附生豐富多樣的微生物。楊雨蒙等[5]從夏黑葡萄表皮分離鑒定孢漢遜酵母(Hanseniasporauvarum)、近玫色鎖擲酵母(Sporidioboluspararoseus)和假絲酵母(Candidazemplinina)。張俊杰等[6]利用宏基因組高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)夏黑葡萄表皮細(xì)菌群落具有高度多樣性，從屬的水平上分析，菌落主要為乳酸菌屬、芽孢桿菌屬、明串珠菌屬和假單胞菌屬等。其儲(chǔ)藏期除了與葡萄自身表皮結(jié)構(gòu)破損程度、溫度、水分等環(huán)境因素有關(guān)，也取決于其表面的附生微生物種類等生物因素。葡萄外表的營養(yǎng)物質(zhì)為這些附生微生物提供了良好的生存環(huán)境，這些附生菌進(jìn)而產(chǎn)生活性物質(zhì)如小分子量的抗菌物質(zhì)、抗菌蛋白或多肽等，使其他病原菌難于生長[7]，保護(hù)葡萄果實(shí)健康生長。因而，篩選鑒定及結(jié)構(gòu)表征夏黑葡萄表面的抑菌附生細(xì)菌，對(duì)于闡明夏黑葡萄表面微生物種類及其生長繁殖特性，開發(fā)安全有效的抑菌活性物質(zhì)用以防控微生物病害具有重要意義。

本研究以夏黑葡萄為研究對(duì)象，利用平板劃線法分離純化培養(yǎng)得到附生細(xì)菌，提取基因組DNA、PCR擴(kuò)增16S rDNA、基因序列測(cè)序，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行聚類分析，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，確定菌種的種屬地位[8]。在此基礎(chǔ)上，以7種食源性致病菌為指示菌，采用打孔法進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，篩選具有抑菌活性的附生細(xì)菌。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

夏黑葡萄：購買自南京市衛(wèi)崗農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

7種供試致病菌均購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)如表1所示。

表1 七種供試致病菌Table 1 Seven test pathogens

7種細(xì)菌及放線菌固體培養(yǎng)基由本實(shí)驗(yàn)室配制(按100 mL計(jì))：

LB培養(yǎng)基(g)：胰蛋白胨1，酵母提取物0.5，NaCl 1，瓊脂1.5～2。PDA培養(yǎng)基(g)：土豆20，葡萄糖2，NaCl 3，瓊脂2。高氏1號(hào)培養(yǎng)基(g)：可溶性淀粉2，K2HPO40.05，F(xiàn)eSO40.001，MgSO4·7H2O 0.05，KNO30.1，瓊脂1.5。淀粉-酪氨酸培養(yǎng)基(g)：可溶性淀粉1，酪蛋白0.1，K2HPO40.05，瓊脂1.75。GYM培養(yǎng)基(g)：葡萄糖0.4，麥芽提取物1，酵母提取物1，蛋白胨0.1，瓊脂1.75。丙氨酸-酪蛋白培養(yǎng)基(g)：酪蛋白0.2，丙氨酸0.4，天冬酰胺0.01，K2HPO40.05，瓊脂1.5。YPD培養(yǎng)基(g)：酵母提取物1，蛋白胨2，葡萄糖2，瓊脂2。

DNATaq酶、DNA marker及PCR相關(guān)試劑,南京諾唯贊生物科技有限公司；Omega細(xì)菌基因組試劑盒(Bacteria DNA Kit 50)及引物,上海捷瑞生物工程有限公司；瓊脂糖凝膠DNA提取試劑盒(Ver.3.0 D823A型)，日本TaKaRa公司；D102ApMD19-T載體,日本TaKaRa公司。

1.2 儀器設(shè)備

臺(tái)式恒溫振蕩器，江蘇太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海江星儀器有限公司；臺(tái)式微量冷凍離心機(jī)(Microfuge 22R型)，美國 Beckman公司；梯度PCR儀(TP600型)，日本TaKaRa公司；電泳儀(DYCP-31DN型)，北京市六一儀器廠；紫外可見分光光度計(jì)(UV-2100)，上海尤尼柯公司；全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像分析儀(JS-380C型)，上海培清科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 附生細(xì)菌的分離、純化

隨機(jī)取數(shù)顆試驗(yàn)葡萄置于無菌研缽中研磨，經(jīng)過濾得葡萄原液。取1 mL葡萄原液至裝有9 mL無菌水的試管中，振蕩搖勻，得濃度為10-1的葡萄稀釋液。同理，依次制備濃度梯度為10-2、10-3、10-4、10-5的葡萄稀釋液。取0.2 mL菌液涂布于上述7種固體培養(yǎng)基，每個(gè)稀釋濃度做3個(gè)平行，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)1～2 d。觀察菌落的特征與形態(tài)，挑取形態(tài)有差異的單菌落通過三區(qū)劃線分離法得到純化單菌落。形態(tài)學(xué)鑒定方法參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[9]和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[10]。最后利用甘油管藏法于-70 ℃下保存菌種備用。

1.3.2 基因組DNA的提取

細(xì)菌基因組DNA的提取采用細(xì)菌基因組試劑盒(bacteria DNA Kit 50)[11]。提取的基因組DNA先進(jìn)行溴化乙錠(ethidium bromide, EB)染色，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(115 V,30 min)。基因組DNA-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 16S rDNA基因片段的PCR擴(kuò)增

16S區(qū)域的擴(kuò)增選擇原核生物16S rDNA的通用擴(kuò)增引物16S(F)(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)/16S(R)(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸100 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。PCR采用50 μL的反應(yīng)體系，包括ddH2O 19 μL、2×TaqMaster Mix 25 μL、16S(F)2 μL、16S(R)2 μL、模板DNA 2 μL。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果。

1.3.4 PCR產(chǎn)物的回收和克隆

采用TaKaRa瓊脂糖凝膠DNA提取試劑盒Ver.3.0(D823A)回收PCR產(chǎn)物，純化產(chǎn)物與pMD19-T載體連接過夜，將其轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中。于含氨芐青霉素(Amp 100 μg/mL)的LB固體培養(yǎng)基平板上涂布轉(zhuǎn)化完成的菌液，37 ℃倒置培養(yǎng)12 h。隨機(jī)挑取白色單菌落，將其接種至含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min下?lián)u菌過夜培養(yǎng)。取1.6 μL菌液進(jìn)行16S rDNA PCR擴(kuò)增，引物為M13-RV(5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′)和M13-47(5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′)。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR采用20 μL的反應(yīng)體系，包括ddH2O 6.8 μL、2×Taq Master Mix 10 μL、M13-47 0.8 μL、M13-RV 0.8 μL、菌液1.6 μL。

1.3.5 DNA序列測(cè)序和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將含有目的DNA序列的菌液交由通用生物系統(tǒng)有限公司進(jìn)行測(cè)序。獲得16S rDNA序列后，通過Ezbiocloud(http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/)網(wǎng)站進(jìn)行序列比對(duì)。利用MEGA 6.0軟件(neighbor joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展數(shù)為1 000。

1.3.6 附生細(xì)菌抑菌活性測(cè)試

利用LB固體培養(yǎng)基活化保藏菌株。挑取單菌落，將其接種至100 mL LB液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)至OD值達(dá)到0.4～0.6。利用預(yù)加菌液傾注平板法[12]制備試驗(yàn)平板，在每個(gè)平板上打5個(gè)孔，然后往孔中注入40 μL目標(biāo)菌液，37 ℃恒溫培養(yǎng)4～6 h后觀察抑菌圈。

1.3.7 菌種發(fā)酵

經(jīng)過抑菌試驗(yàn)篩選出具有抑菌活性的微生物，將其接種于LB固體培養(yǎng)基，于37 ℃下使其活化。無菌條件下，用接種環(huán)從中蘸取菌體，接種于內(nèi)裝15 mL LB液體培養(yǎng)基的小三角瓶?jī)?nèi)，于37 ℃、180 r/min下過夜培養(yǎng)形成種子培養(yǎng)液，按3%接種量接種于含100 mL LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在37 ℃、180 r/min下發(fā)酵7 d。

1.3.8 細(xì)菌次級(jí)代謝產(chǎn)物粗提取

往發(fā)酵液中加入等體積丙酮破碎細(xì)胞，使其細(xì)胞內(nèi)容物釋放出，靜置過夜后得含有次級(jí)代謝產(chǎn)物的菌體裂解液。將裂解液抽濾除去菌體殘?jiān)⒅糜谛D(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓濃縮一半體積得濃縮液。用等體積的乙酸乙酯萃取2次，將其置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干。用適量有機(jī)試劑重溶即得次級(jí)代謝產(chǎn)物粗提物。

1.3.9 細(xì)菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的鑒定

粗提物過有機(jī)濾膜(0.22 μm)后進(jìn)行ESI-MS分析。質(zhì)譜參數(shù):電噴霧離子源(ESI)，500 ℃，氣簾氣25.0 psi，噴霧電壓5500.0 V，離子源氣1∶55.0 psi，離子源氣2∶50.0 psi。

2 結(jié)果分析

2.1 形態(tài)特征

經(jīng)LB培養(yǎng)基平板劃線純化，37 ℃培育12 h后，察看菌株單菌落形狀特征如圖1所示。

菌株BDA-1、BDC-4、BDD-2、BDG-3、BDG-7的菌落呈圓形，菌株BDD-1、BDG-1、BDG-4、BDG-5的菌落呈不規(guī)則形狀；菌株BDA-1、BDD-1、BDG-1、BDG-4、BDG-3、BDG-5、BDG-7的菌株呈現(xiàn)白色，菌株BDC-4呈淡紅色，菌株BDD-2呈淡黃色；菌株BDA-1、BDC-4、BDG-1、BDG-5中心凸起，菌株BDD-1、BDD-2、BDG-4、BDG-3、BDG-7中心平整；菌株BDA-1、BDC-4、BDD-1表面光滑濕潤，菌株BDD-2、BDG-1、BDG-4表面粗糙干燥，菌株BDG-3、BDG-5、BDG-7表面粗糙濕潤。

圖1 九種菌株的單菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of 9 strains

2.2 DNA序列測(cè)序和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

9種菌株的16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小均在1 500 bp左右(圖2)，與理論值一致[13]。

圖2 九株附生細(xì)菌的16S rDNA序列PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification of 16S rDNA sequences of 9 epiphytic bacteria

以菌株BDC-4為例,16S rDNA序列經(jīng)Ezbiocloud網(wǎng)站分析比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與萎蔫短小桿菌相應(yīng)序列的同源性最高，相似性達(dá)99.58%。通過MEGA6.0軟件利用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖3所示。菌株BDC-4與萎蔫短小桿菌聚為同一枝，自展值為100，親緣關(guān)系最近，鑒定其為萎蔫短小桿菌。

圖3 基于菌株BDC-4 16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic Construction Based on 16S rDNA Sequences of BDC-4 Strain

同理，將菌株BDG-1、BDG-3、BDG-4、BDG-5、BDG-7、BDD-1、BDD-2、BDA-1、BDC-4分別鑒定為假蕈狀芽孢桿菌(Bacilluspseudomycoide)、加拿大假單胞菌 (Pseudomonascanadensis)、節(jié)桿菌內(nèi)生亞種(Arthrobacterendophyticus)、貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)、阿耶波多氏芽孢桿菌(Bacillusaryabhattai)、南極帕金格氏桿菌(Paeniglutamicibacterantarcticus)、Pseudomonasparalactis、巨大芽胞桿菌(Bacillusmegaterium)、萎蔫短小桿菌(Curtobacteriumflaccumfaciens)，如圖3～圖7、表2所示。

圖4 基于菌株BDG-4 16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic construction based on 16S rDNA sequences of BDG-4 strain

圖5 基于菌株BDG-1，BDG-5，BDG-7及BDA-1 16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic construction based on 16S rDNA sequences of strains BDG-1, BDG-5, BDG-7 and BDA-1

圖6 基于菌株BDG-3與BDD-2 16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic construction based on 16S rDNA sequences of BDG-3 strain

2.3 抑菌活性分析

對(duì)從夏黑葡萄中共分離得到的9株附生菌株進(jìn)行抑菌活性測(cè)定，結(jié)果顯示菌株BDG-5和BDD-2具有抑菌活性(如圖8所示)，抑菌效果見表3。

BDG-5(貝萊斯芽孢桿菌)對(duì)大腸桿菌有一定的抑菌活性，抑菌圈直徑小于10 mm；對(duì)白念球菌有較強(qiáng)的抑菌活性，抑菌圈直徑10～15 mm；對(duì)四聯(lián)球菌有很強(qiáng)的抑菌活性，抑菌圈直徑大于15 mm。BDD-2(P.paralactis)對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑大于15 mm，抑菌活性很強(qiáng)；對(duì)于白念球菌，BDD-2與BDG-5的抑菌效果類似。

圖7 基于菌株BDD-1 16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic construction based on 16S rDNA sequences of BDD-1 strain

表2 九株細(xì)菌16S rDNA 序列同源性分析比對(duì)結(jié)果Fig.2 16S rDNA sequence homology analysis alignment results of nine strains of bacteria

編號(hào)菌株編號(hào)同源菌株名稱登錄號(hào)覆蓋率/相似度/%1BDG-1Bacillus pseudomycoides DSM 12442(T)ACMX01000133100/99.932BDG-3Pseudomonas canadensis 2-92(T)AYTD01000015100/99.863BDG-4Arthrobacter endophyticus EGI 6500322(T)KM114214100/99.384BDG-5Bacillus velezensis CR-502(T)AY603658100/99.865BDG-7Bacillus aryabhattai B8W22(T)EF114313100/1006BDD-1Paeniglutamicibacter antarcticus SPC26(T)AM931709100/98.837BDD-2Pseudomonas paralactis WS4992(T)KP756923100/99.798BDA-1Bacillus megaterium NBRC 15308(T)JJMH01000057100/99.869BDC-4Curtobacterium flaccumfaciens LMG 3645(T)AJ312209100/99.58

圖8 BDG-5(a)、BDD-2(b)對(duì)白念球菌的抑菌效果圖Fig.8 Antibacterial effect of BDG-5(a),BDD-2(b) against Candida albicans

表3 對(duì)7種致病菌的抑菌活性結(jié)果Table 3 Antibacterial activity results for seven pathogenicbacteria

ABCDEFGBDG-1-------BDG-3-------BDG-4-------BDG-5+----+++++BDG-7-------BDD-1-------BDD-2----+++-++BDA-1-------BDC-4-------

注：A-大腸桿菌；B-恥垢分枝桿菌；C-產(chǎn)氣莢膜桿菌；D-枯草芽孢桿菌；E-金黃色葡萄球菌；F-四聯(lián)球菌；G-白念球菌；-：無活性；+：抑菌圈直徑<10 mm；++：抑菌圈直徑為10～15 mm；+++：抑菌圈直徑>15 mm。

2.4 發(fā)酵粗產(chǎn)物結(jié)構(gòu)分析

對(duì)目標(biāo)菌株發(fā)酵粗提物進(jìn)行ESI-MS 分析，結(jié)果如圖9所示。菌株BDD-2的粗提物在陽離子模式下出現(xiàn)m/z1 058.712[M+Na]+、m/z1 044.673、m/z1 030.657的碎片離子峰，或?yàn)閙/z1 058.712、m/z1 044.673[M+H]+、m/z1 030.657，推測(cè)這一組物質(zhì)為脂肽物質(zhì)surfactin或iturin C；此外，還出現(xiàn)了m/z1 074.689[M+K]+、m/z1 046.618、m/z1 102.681的碎片離子峰，推測(cè)這一組物質(zhì)為surfactin。以上數(shù)值說明該化合物的分子量為1 036，通過對(duì)比脂肽抗生素各種類的理論分子質(zhì)量，推斷P.paralactis發(fā)酵可能產(chǎn)生環(huán)脂肽類化合物surfactin。同時(shí)，從圖9中可發(fā)現(xiàn),在相同ESI-MS模式下出現(xiàn)m/z1 080.684[M+Na]、m/z1 096.645[M+K]的離子峰，1 044為脂肽類家族iturin的iturin C的分子質(zhì)量，推測(cè)P.paralactis的發(fā)酵產(chǎn)物可能含有iturin C。

圖9 菌株BDD-2發(fā)酵產(chǎn)物質(zhì)譜圖Fig.9 Mass spectrometry of strain BDD-2 fermentation product

從圖10中可見，貝萊斯芽孢桿菌的粗提物在陽離子模式下出現(xiàn)m/z1 058.730[M+Na]+、m/z1 044.691、m/z1 030.661及m/z1 074.752[M+K]+、m/z1 102.659的離子峰碎片，以上均為Surfactin類化合物的特征分子離子質(zhì)量[14]。本實(shí)驗(yàn)也得到了含鈉同系物為m/z1 065.595、m/z1 051.625、m/z1 079.640、m/z1 093.653，含鉀同系物為m/z1 081.577、1 095.647的分子離子峰，為iturin A的特征離子峰，與已有文獻(xiàn)報(bào)道的經(jīng)LC-MS分析和HPLC分析得到的結(jié)果一致[15]，故推測(cè)該物質(zhì)屬于iturin A族衍生物。根據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道的Bacillussp. LM7產(chǎn)生的具有生物活性的bacillomycin D脂肽物質(zhì)，測(cè)得C14 bacillomycin D的分子離子峰為m/z1 032.5426[16]，本實(shí)驗(yàn)測(cè)得了m/z1 018.803[M+H]+的離子峰，與前者相差一個(gè)亞甲基，還有m/z1 040.790[M+Na]+、m/z1 056.836[M+K]+，以上均可推測(cè)貝萊斯芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)生了脂肽家族iturin中的物質(zhì)bacillomycin D。

圖10 菌株BDG-5發(fā)酵產(chǎn)物質(zhì)譜圖Fig.10 Mass spectrometry of Strain BDG-5 fermentation product

3 結(jié)論與討論

本研究從夏黑葡萄中分離鑒定了9株細(xì)菌，抑菌實(shí)驗(yàn)表明BDG-5和BDD-2具有顯著的抗菌活性，運(yùn)用16S rDNA序列分析分別鑒定為B.velezensis和P.paralactis。2株菌進(jìn)一步發(fā)酵后，提取發(fā)酵產(chǎn)物，經(jīng)ESI-MS分析初步確定發(fā)酵產(chǎn)物中具有抑菌活性化合物的結(jié)構(gòu)分別為surfactin、iturin C、iturin A和bacillomycin D。

金疏桐等[17]于2017年首次從盾葉薯蕷植物中分離出貝萊斯芽孢桿菌，其次級(jí)代謝產(chǎn)物通過抑菌試驗(yàn)表現(xiàn)出了廣譜的抗病原細(xì)菌活性，同時(shí)在一定程度上也顯示了拮抗耐藥菌的能力，但未闡明抗菌作用物質(zhì)及結(jié)構(gòu)特征。宗英等[18]利用平板對(duì)峙法，從感染赤霉病的麥穗上分離篩選出了具有顯著抑制禾谷鐮刀菌活性的附生細(xì)菌，并將其鑒定為貝萊斯芽孢桿菌，通過氣相色譜-質(zhì)譜法對(duì)發(fā)酵液中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行了分析，其中純化的4種單成分對(duì)鐮刀菌生長的抑制效果明顯。此外，一些芽孢桿菌在生長代謝過程中，會(huì)由非核糖體合成表面活性素(surfactin)、伊枯草菌素(iturin)、芬薺素(fengycin)三大類常見的具有表面活性的脂肽[19]。其中surfactin除具有表面活性外，還可抑制細(xì)菌、病毒、真菌、支原體的生長[20]。iturin族是一類小分子環(huán)脂肽類物質(zhì)，抗真菌效果通常顯著，抗細(xì)菌作用有限，某些成員具有溶血作用[21]。基于此，本研究發(fā)現(xiàn)從夏黑葡萄中分離出的菌株BDG-5產(chǎn)生了具有廣譜抗致病菌性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，故推測(cè)其屬于脂肽家族。通過對(duì)比脂肽抗生素各種類的理論分子質(zhì)量(目標(biāo)分子質(zhì)量為1 000～2 000)，推測(cè)B.velezensis菌種發(fā)酵產(chǎn)生了surfactin及iturin家族中的iturin A與bacillomycin D。B.velezensis屬于芽孢桿菌屬，本研究發(fā)酵得次級(jí)代謝產(chǎn)物中的surfactin物質(zhì)與楊柯等[22]從鹽生海蘆筍中分離得到2株具有抑菌活性的芽孢桿菌屬的發(fā)酵產(chǎn)物一致。目前的研究[23]已闡明，通過芽孢桿菌與植物間的相互作用，這些脂肽物質(zhì)在促進(jìn)植物宿主防御機(jī)制上起到了重要作用，芽孢對(duì)干旱的高抗性在抗菌物質(zhì)的穩(wěn)定形成及植物原料的貯存運(yùn)輸上起著重要的作用。因此，夏黑葡萄的生長發(fā)育及采摘后的運(yùn)輸儲(chǔ)藏與其表面的附生微生物有密切的聯(lián)系。

NEUBECK等自牛乳中分離得到P.paralactis，首次明確為新種[24]，但僅僅研究了其形態(tài)學(xué)特征及生理生化特性，并沒有對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)物的生物活性及其化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。本研究發(fā)現(xiàn)菌株BDD-2產(chǎn)生了2個(gè)主要抗致病菌環(huán)脂肽surfactin和(或)iturin C，其抑制金黃色葡萄球菌與白念球菌的活性較強(qiáng)，值得進(jìn)一步深入研究。

本研究結(jié)果表明，葡萄表面含有種類多樣的附生菌，其中有些菌株能夠產(chǎn)生具有顯著抑菌活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物——環(huán)脂肽，該研究結(jié)果對(duì)深入研究附生菌的抑菌機(jī)理，從分子水平揭示生物防控的機(jī)制，為拮抗菌的定向培育、改造工程提供理論依據(jù)[25]，也為生產(chǎn)上開發(fā)新型殺菌劑提供參考。