風羊腿微生物特征及其對風味特性的影響

張佳敏，王衛，吉莉莉，白婷，陳林，劉達玉

(成都大學 藥學與生物工程學院，四川 成都，610106)

中國的羊肉制品歷史悠久，包括腌臘、醬鹵、燒烤等多個類型近百種產品，其中風羊腿是最有代表性的傳統腌臘肉制品之一，產品以羊腿為原料，經修整、上鹽、腌制、自然風干、貯藏成熟等工序加工而成，加工期在30 d以上[1-3]。對中國傳統腌臘肉制品的研究表明，在自然風干及貯藏過程中，肉品原料會發生一系列有利于風味形成的理化及微生物變化，尤其是在風干環節，隨著水分的降低，還伴隨著脂肪和蛋白質的分解、氧化等反應，逐漸產生醛、酮、酸等一系列小分子化合物，從而形成產品獨有的風味特征[4-5]。對發酵肉制品的研究顯示，在發酵過程中微球菌和非致病性葡萄球菌中含有豐富的蛋白酶和脂肪酶，可將蛋白質和脂肪分解為氨基酸和脂肪酸，對產品風味形成產生重要影響，即使是在中式腌臘肉制品中，這一基于微生物的風味形成途徑對于緩慢風干的產品也不可或缺[6-7]。目前已有關于利用微生物發酵劑的方式提升中國傳統腌臘制品風味和品質，縮短發酵期，實現安全性可控的研究報道，如劉曉強等[8]利用篩選出的戊糖片球菌、變異微球菌、木糖葡萄球菌和乳酸菌用于火腿，以改善風味，降低亞硝酸鹽殘留；蔣云升等[9]采用微生物發酵制作兔肉發酵制品以提升產品中游離氨基酸含量；王衛等接種促進風味形成為主導的發酵微生物，如肉色葡萄球菌、木糖葡萄球菌等的復合菌種，加工出符合中式消費習慣的臘腸和臘肉等肉制品，顯著提升產品風味[10]，對風羊腿中微生物的特征及其風味特性目前尚缺少系統研究。

Biolog-ECO微生物分析系統是一種通過監測微生物對不同碳源底物利用程度，用以描述微生物群落特征的快速、簡便的方法，由于Biolog分析法可實現大范圍、快速、自動化和標準化的微生物檢測，已被廣泛應用于土壤、水質中微生物群落分析[11-13]，以及環境修復效果評價等方面，但其應用范圍還較窄[14-15]，特別是在食品領域應用很少，目前在中式發酵食品中的應用主要為探究泡菜和酒曲中微生物多樣性[16-17]。本研究將其應用于腌臘肉制品，以自然風干法和添加微生物發酵劑風干法加工風羊腿，采用Biolog-ECO微生物分析系統對產品中微生物群落的代謝特征以及多樣性特征進行分析，并結合氣相色譜-質譜聯用儀(gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS)進一步對產品中揮發性風味物進行檢測，探究微生物調控對產品微生物群落和風味特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮帶皮羊腿：四川北牧南江黃羊集團有限公司；SM-194凍干菌，復合菌種為肉葡萄球菌、木糖葡萄球菌、戊糖片球菌、清酒乳桿菌和漢遜德巴利酵母菌(Staphylococcuscarnosus，Staphylococcusxylosus，Pediococcuspentosaceus，Lactobacillussakei，Debaromyceshansenii)，德國Chr. Hansen公司。

電子天平(TJA3130N)，上海民橋精密科學儀器有限公司；水浴鍋(DZKW-4)，北京中興偉業儀器有限公司；微生物鑒定系統Biolog-ECO，MicroStation；氣相色譜/質譜聯用儀，美國安捷倫；拍打式勻漿機(XY-05)，寧波新藝超聲設備有限公司；微量加樣器(100-1000)，瑞士索科；生化培養箱(LRH-250)，上海一恒科學儀器有限公司。

1.2 風羊腿制作

(1)產品配方

傳統自然風干組(A組)：以整只羊后腿為原料，每1 000 g肉料添加食鹽70 g、亞硝酸鈉0.1 g、D-異抗壞血酸鈉0.8 g、葡萄糖5.0 g、八角2 g、花椒4 g。

添加微生物發酵菌組(B組)：添加SM-194凍干菌，其他與A組相同。

(2)制作工藝

修整→上鹽→入缸腌制(4 ℃，12 d，其間上下翻動3～4次)→清洗晾掛→自然風干(至脫水15%)→修割整形→發酵風干(8～12 ℃，相對濕度50%～65%，18 d，至失重30%～32%)→切段、真空包裝→貯藏、后發酵(6～8 ℃，30 d)→成品

1.3 檢測指標及方法

1.3.1 基于Biolog-ECO法的微生物特性分析

在Biolog-ECO平板上有96個微孔，包含3組相同的碳源配置，每組包含1個空白對照和31份不同類型的單一碳源以及相同含量的四唑紫染料(tetrazolium violet, TV)。微生物在利用碳源過程中產生的自由電子與染料發生還原顯色反應，利用顏色反映的濁度差反映微生物對碳源的利用程度[18]。

在風羊腿中段深入表皮1 cm下取樣，將肉樣剪碎后，加入生理鹽水(0.9 %的NaCl)225 mL，用拍打式均質機均質5 min后取1 mL均質液，用生理鹽水稀釋100倍后，取稀釋的懸濁液加入Biolog-ECO平板，每孔為15 μL。將平板置于30 ℃培養箱中培養，每隔24 h用酶標儀測定96個孔在590 nm和750 nm下的吸光度[18-19]。微生物對碳源的代謝強度用平均吸光度(average well color development，AWCD)表示，計算公式為：

(1)

式中：A590,反應孔590nm時的吸光度；A750,反應孔750nm時的吸光度。

微生物對各類碳源的代謝強度采用吸光度分率表示[20]，其定義式為：

(2)

(3)

式中：Pi,第i種碳源的吸光度分率；Pj,第j類碳源的平均吸光度分率；nj,第j類碳源的數目。

采用豐富度指數(S)來評估微生物物種的豐富度，即被微生物利用的碳源總數，為每孔中(A590～A750)的值大于0.25的孔個數[21]；采用Shannon-Wiener指數(H′)來表示系統中微生物的功能多樣性，H′值定義見公式(4)[18]；采用均勻度指數(E)來表示群落實測多樣性與最大多樣性的比率，E值定義見公式(5)[19]；采用Simpson指數(D)來說明最常見種的優勢度，D值定義見公式(6)[19,21]。

H′=-∑Pi·lnPi

(4)

E=H′/Hmax=H′/lnS

(5)

(6)

1.3.2 揮發性風味成分測定

參考TABANELLI等[22]的方法，并稍作修改。在風羊腿中段深入表皮1 cm下取樣，將肉樣剪碎后，準確稱取3.0 g粉粹均勻的樣品，放入15 mL頂空瓶中密封，采用動態頂空制樣。GC-MS分析圖譜經計算機和人工把每個峰同時與NIST library和Wiley Library相匹配檢索定性，匹配度和純度大于800(最大值1 000)作為定性分析結果。對化合物進行定量分析時，對總離子流量色譜圖用峰面積歸一化法定量，得出各組分的相對含量。

固相微萃取條件：固相微萃取頭CAR/PDMS 75 μm(美國SUPELCO公司)；萃取溫度：80 ℃；萃取時間：40 min；解吸時間：3 min；儀器條件：HP 6890/5973 GC/MS(美國安捷倫科技有限公司)；色譜柱：HP-INNOWAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣口溫度：250 ℃；分流比：2∶1；升溫程序：起始溫度50 ℃，保持3 min，以每分鐘5 ℃升至150 ℃，再以每分鐘10 ℃升至260 ℃；離子源：EI；電離能量：70 EV；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；質量掃描范圍：20～450 amu。

2 結果與分析

2.1 微生物代謝活性分析

基于Biolog-ECO法的微生物特性分析結果，傳統自然風干組(A組)和添加微生物發酵劑組(B組)的AWCD變化曲線如圖1所示。AWCD曲線的變化速率反映了微生物的平均代謝活性，AWCD值增加越快，表明微生物的平均代謝活性越高[15]。由圖1可見，2組產品的AWCD曲線大致都包含了停滯期、對數生長期和穩定期3個階段，總體變化趨勢為前24 h微生物活性低，24～48 h開始升高，48～72 h趨于平緩，72 h后顯著升高，144 h后進入平穩階段。對比2組風羊腿的微生物活性強弱可看出，B組的AWCD值在前72 h低于A組，但72 h后B組的AWCD值顯著升高，微生物代謝活性大大高于A組。在發酵初期代謝活性不及自然風干組，而在培養72 h后，B組的菌群代謝活性大大提高，因而AWCD曲線增長明顯加快，且顯著高于A組，在144～168 h的平穩階段，B組的代謝活性約為A組的1.7倍。由此可見，所添加的微生物發酵菌在經過適應期后，其代謝活性大大高于原生菌群，菌種的作用效果需經較長時間的發酵方可顯現。

圖1 風羊腿AWCD變化曲線Fig.1 Change of AWCD value of goat ham

2.2 微生物特征分析

Biolog-ECO平板碳源分為聚合物類、氨基酸類、酯類、醇類、胺類、酸類6大類，微生物對各類碳源的代謝能力采用吸光度分率表示，用以分析微生物對不同種類碳源的代謝特性[21]。分析得到2組產品微生物對6類碳源代謝能力的平均吸光度分率如圖2所示。

圖2 兩組風羊腿微生物對6類碳源的利用特征Fig.2 Changes in AWCD for six substrate categories of two groups of goat ham

由圖2可見，各類碳源的平均吸光度分率均隨時間的延長而增強，B組對6類碳源的利用強度整體較高，尤其是對醇類和酸類物質的代謝強度，在整個培養期內都高于A組。而其他幾類碳源的代謝情況是在培養96～120 h后方才表現為B組高于A組。

2.3 微生物多樣性分析

單一系統中微生物群落特性可以用Shannon-Wiener指數(H′)、均勻度指數(E)以及Simpson指數(D)等來表征，用以反映微生物群落功能多樣性的不同側面[18,20]。豐富度指數S為群落中總的物種數，Shannon-Wiener指數H′是反映豐富度和均勻度的綜合指標，其包含著2個成分：種數(species)和各種間個體分配的均勻性(evenness)，種數越多，各種之間個體分配越均勻，H′值就越大[23]。以2組樣品微生物代謝強度曲線達到快速增長期，即96 h時的AWCD進行比較分析，結果如表1所示。

表1 兩組風羊腿微生物群落多樣性指數Table 1 Diversity indices of microorganism communitiesin two groups of goat ham

2組產品的差異主要體現在豐富度指數S和多樣性指數H′上，B組的豐富度指數S和多樣性指數H′均高于自然風干組，說明2組產品在多樣性上的差異主要是由物種數量上的差異造成的，B組產品由于添加了微生物發酵劑，且添加的菌種在后期貯藏過程中較好地適應了產品內環境，顯示出較強的代謝活性，從而增加了樣品中微生物的豐富度和多樣性，而2組產品的菌群在均勻度指數E和Simpson指數D差異不大。

2.4 揮發性風味成分分析

采用GC-MS分析法對2組羊腿中揮發性風味物質測定結果見圖3和表2，2組產品風味物種類對比見圖4。

圖3 風羊腿揮發性風味成分總離子流圖Fig.3 The TIC of volatile flavor components of goat ham

就風味物相對含量比較，A組含量最高的為醇類(34.433%)和酸類(28.225%)，其次分別為醛類(8.392%)、酮類(6.405%)、烯烴類(4.733%)、酚類(2.476%)、酯類物質未檢出(0.000%)；B組含量最高的為醇類(39.179%)和醛類(23.779%)，其次分別為酸類(16.144%)、烯烴類(7.980%)、酯類(4.685%)、酮類(5.892%)、酚類(0.230%)。而從生成的風味物種類分析，A組依次為：酸類(8種)>醇類(5種)>醛類(4種)>烯烴類(3種)=酚類(3種)>酮類(2種)>酯類(0種)；B組依次為：醛類(13種)>醇類(8種)=酸類(8種)>酯類(5種)>酮類(3種)>烯烴類(2種)=酚類(2種)。A組共檢出25種，B組共檢出41種，結合微生物代謝特征和多樣性檢測分析結果，添加發酵劑的產品中揮發性風味成分的種類極顯著多于傳統風干組，顯然與其菌群具有較高的微生物代謝活性有密切關聯，微生物發酵劑對風羊腿風味物質形成具有促進作用，這與王衛等[10]在微生物發酵劑對四川臘腸和臘肉風味影響的研究中的結果相符。

表2 風羊腿揮發性風味物質比較Table 2 Comparison of volatile flavor of goat ham

續表2

種類化合物名稱相對百分含量/%A組B組醛類2-Undecenal 2-十一碳烯醛-0.551Benzaldehyde,4-(1-Methylethyl) 4-異丙基苯甲醛-0.525Pentadecanal 十五醛0.688-Hexadecanal 十六醛-0.14總量8.392(4種)23.779(13種)酮類2-Butanone,3-hydroxy 3-羥基-2-丁酮2.7013.5422-Cyclohexen-1-one,3-methyl-6-(1-methylethyl)2-羥基-6-甲基-3-(1-甲乙基)-2-環己烯-1-酮3.704-2,3-Octanedione 2,3-二酮-2.0613,5-Octadiene-2-one 3,5-二烯酮-0.289總量6.405(2種)5.892(3種)酸類Acetic acid 乙酸22.8169.973Butanoic acid 丁烷酸2.1320.22Pentanoic acid 戊酸0.12-Hexanoic acid 己酸-0.878heptanoic acid 庚酸1.902-Caprylic acid 辛酸0.8450.15Nonanoic acid 壬酸0.162.543Decanoic acid 癸酸0.132.032-Decenal,(Z) 順,2-癸酸-0.21dodecanoic acid 十二酸0.12-Hexadecanoic acid 十六酸-0.14總量28.225(8種)16.144(8種)酚類Phenol 苯酚0.110.125Phenol,3-methy 3-甲基-苯酚-0.105Phenol,4-methyl 4-甲基-苯酚0.15-Eugenol 丁香油酚2.216-總量2.476(3種)0.230(2種)酯類Ethyl Caprylate 辛酸乙酯-2.5323-Cyclohexen-1-ol,4-methyl-1-(1-methylethyl)2-甲基-丙酸-1-甲基-1-(4-甲基-3-環己烯-1-基)乙酯-0.14Ethyl Caprate 癸酸乙酯-1.748Tetradecanoic acid,ethyl ester 肉豆蔻酸乙酯-0.155Hexadecanoic,ethyl ester 棕櫚酸乙酯-0.11總量0(0種)4.685(5種)總風味物種類數25種41種

注：“-”表示未檢測出。

對產品中各類風味成分進行分類分析比較，醇類物質在A組中檢測到5種，在B組中檢測到8種，2組中均檢測到的物質為乙醇、正戊醇、沉香醇、α,松油醇和苯甲醇；添加了發酵劑的B組產品α，松油醇和苯甲醇含量較A組有所提升，此外還檢測出了1-己醇、2-辛烯-1-醇和正辛醇。醇類物質中的不飽和醇閾值較低，對風味的形成產生一定貢獻[25]。

醛類化合物主要來自于脂肪氧化和降解[24]。醛的閾值一般很低，具有脂肪香味，是肉香味的主要成分[25]。A組產品中檢測出了4種醛類化合物，總量為8.392%，其中主要為壬醛，含量為7.234%；B組產品中檢測出了13種醛類化合物，總量為23.779%，與A組相比，醛類化合物的種類和含量均得到提升，其中己醛是亞油酸的主要氧化產物，苯甲醛是苯丙氨酸的降解產物[26]，它們對整體風味的形成起著重要作用，說明微生物對提升醛類化合物含量具有較強的促進作用。

酸類物質在2組產品中均檢測出8種，總量分別為28.225%和16.144%，主要為乙酸，但B組乙酸含量與A組相比大大降低，結合微生物對碳源的利用情況分析，可能與微生物對酸類底物的利用強度較高有關。酯類物質在A組中未檢出，在B組中檢出5種，以辛酸乙酯和癸酸乙酯為主，具有果香和酒香香氣，對風味有促進作用。對比可見，添加了微生物發酵劑的B組產品酸類物質有所降低，而酯類物質含量得到提升。烯烴類化合物及酚類化合物2組產品之間差異不大。

圖4 揮發性風味物質種類Fig.4 Varieties of volatile flavor compounds

3 結語

采用基于Biolog-ECO微生物分析系統的微生物特征分析，以及GC-MS對揮發性風味物的檢測，比較了添加或不添加微生物發酵劑對自然風干發酵的風羊腿微生物特性和風味的影響。結果表明，SM-194微生物發酵劑對風羊腿的AWCD值產生顯著影響，盡管在發酵初期添加發酵劑的產品微生物代謝活性略低，但隨發酵風干期的延長顯著升高，且對6類碳源的利用強度也整體高于對照組的原生菌群，對風羊腿中底物的分解能力更強，尤其對促進酯類物質的形成效果更佳。

微生物多樣性分析表明，添加微生物發酵劑組的多樣性指數H’和豐富度指數S均高于對照組，而均勻度指數E和優勢度指數D差異不明顯。進一步的風味物種類和含量檢測結果顯示，添加微生物發酵劑后，風羊腿的風味物種類達到41種，而未添加組僅為25種，尤其是在醇類、醛類及酯類物質的種類和含量上，添加微生物發酵劑組均更為豐富，其中，醇類物質增加了3種，醛類物質增加了9種，酯類物質檢測出5種，而未添加發酵劑的產品未檢出酯類物質。

傳統自然風干腌臘肉制品在工藝和產品特性上可歸結為發酵肉制品類型，風干發酵進程中微生物的參與，尤其是微生物種類和含量對產品的特有風味的形成具有重要的作用。結果表明，微生物發酵劑對自然風干腌臘肉制品微生物多樣性的提升，顯然有益于產品風味物成分的形成。而且隨著發酵貯藏期的延長SM-194微生物發酵菌所顯現的作用才會更加顯著。