短小芽孢菌HN-10抗菌肽P-2對雙孢蘑菇保鮮效果的影響

牛耀星，贠建民，李彥虎，郭娟，鄧展瑞，劉小霞

(甘肅農業大學 食品科學與工程學院,甘肅 蘭州,730070)

近年來，我國食用菌產業發展迅速，已成為當今世界食用菌的生產和出口大國，其中，雙孢蘑菇已成為工廠化生產中產量最大的一種。但由于新鮮雙孢蘑菇自身組織脆嫩，營養價值高，含水量較高，呼吸強度大等易腐爛的特點，在采后貯藏運輸過程中極易受到微生物侵染，引起食用菌子實體變色甚至腐爛[1]，降低了雙孢蘑菇的商品價值和食用價值，對食用菌工業造成損失。而食用菌保鮮最主要的兩大因素，首先是控制其衰老進程，其次控制微生物[2]。研究證明，低溫下能夠有效降低果蔬采后的呼吸速率，延緩衰老[3]。目前對于微生物的抑制主要是通過使用抗生素和傳統的化學保鮮劑來保鮮，但是長期使用不僅危害人體健康，使腐敗菌產生耐藥性，且易造成環境污染[4]。因此，亟待開發出一種新型綠色的食用菌保鮮劑來抑制雙孢蘑菇采后微生物侵染引起的腐敗變質。

抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)，又稱肽抗生素或抗微生物肽，是一種廣泛存在于生物界中的新型抗菌物質，具有廣譜的抗菌活性和不易產生耐藥性，抗菌肽熱穩定性和水溶性好等特點，對高等動物的正常細胞幾乎無毒害作用[5]。目前，抗菌肽在植物保護、食品保鮮、藥劑開發等領域已經得到了廣泛的應用[6]。最早在1980年歐洲各國就已經將鏈球菌素添加到食品中作為天然的防腐劑使用，并且也是當時世界衛生組織認可的細菌素食品使用防腐劑[7]。在1990年，DELVES用nisin保鮮牛奶、肉湯，延長了其保藏期[8]。近年來已有抗菌肽應用于荔枝[9]，牛肉[10]，草莓汁、牛奶、饅頭、豬肉[11]，柑橘[12]等防腐保鮮中的研究，均具有一定的保鮮效果，但目前國內外對于將抗菌肽作為保鮮劑應用于食用菌保鮮的研究還比較少見。

為此，本文以新鮮的雙孢蘑菇子實體為材料，以實驗室前期分離鑒定的1株短小芽孢菌(Bacilluspumilus)HN-10菌株經過發酵液粗提和初步分離后的提取液為防腐保鮮劑原液(有效成分為抗菌肽P-2)，經稀釋成不同濃度梯度后對雙孢蘑菇進行噴涂處理，開展常溫和低溫防腐保鮮貯藏試驗，通過測定雙孢蘑菇的感官指標，篩選出抗菌肽保鮮雙孢蘑菇的最佳濃度，并以最優濃度再次對雙孢蘑菇進行噴涂處理后低溫貯藏，以期延長雙孢蘑菇保質期。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雙孢蘑菇920，采自張掖市愛福農業發展股份有限公司，當天4 h內運回實驗室后，放入冷庫(4±1) ℃預冷2 h，剔除病、傷菇體，挑選菇蓋大小均勻(直徑約30～40 mm)、成熟度一致，無病，無機械損傷的雙孢蘑菇，分組并立即進行試驗。

短小芽孢菌(B.pumilus)HN-10菌株，為甘肅農業大學食品科學與工程學院微生物實驗室分離鑒定保存的產抗菌肽P-2菌株。

聚乙二醇6000(PEG 6000)、交鏈聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、鄰苯二酚、均為國產分析純，天津光復精細化工研究所；牛血清蛋白生化試劑，上海源聚生物公司；12 000～14 000 D透析袋，上海源葉生物科技有限公司；

LB培養基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，瓊脂15 g，水1 000 mL，pH 7.0，用于培養短小芽孢桿菌(B.pumilus)HN-10菌株。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1FD潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；THZ-98A恒溫振蕩器、HWS-型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學儀器有限公司；PHS-3C型pH計、UV756CRT紫外可見分光光度計、FA1004B 電子天平，上海佑科儀器儀表有限公司；101-1-S-Ⅱ電熱恒溫培養箱，北京科偉永興儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 短小芽孢菌HN-10抗菌肽P-2的粗提與初步純化

取一環短小芽孢桿菌(B.pumilus)HN-10 接種至LB液體培養基中，37 ℃、200 r/min下培養72 h；將培養好后的菌液于4 ℃、8 000 r/min下離心20 min，收集上清液，然后向無菌的上清液中加入(NH4)2SO4至75 %飽和度，4 ℃下靜置，沉淀過夜；將沉淀后的菌液于4 ℃、8 000 r/min離心 20 min，除去上清液，加入20 mmol/L pH值6.8 PBS緩沖液溶解沉淀，后放入截留分子量為 12 000～14 000 D的透析袋中脫去(NH4)2SO4，透析48 h后，收集袋內樣品，即得到具有抗菌活性的粗提液。然后采用AB-8大孔吸附樹脂對粗提物進行純化，取 20 mL粗提物，加載進AB-8大孔吸附樹脂，體積分數70%乙醇洗脫，流速為2 BV/h，收集洗脫液，排除乙醇殘留，即得防腐保鮮劑原液，在4 ℃下保存備用。

1.3.2 抗菌肽噴涂處理

挑選菇蓋大小均勻的雙孢蘑菇，每30個子實體為1組(約600 g)，使全部菇體側位放置，采用無菌小型噴霧器，按順序均勻噴涂經無菌水按1∶1、1∶2、1∶3(V/V)比例稀釋的各濃度抗菌肽保鮮液20～30 s，約10 mL，以無菌水處理作為對照，將雙孢蘑菇通風20 min，在冷庫(4±1)℃預冷2 h后備用，開展保鮮貯藏試驗。

1.3.3 常溫濃度篩選試驗

將噴涂完成后的雙孢蘑菇裝框并封上保鮮膜，轉移至室溫(25±1)℃、RH 80%～90%條件下存放，然后用消毒牙簽在用保鮮膜密閉的保鮮框上均勻戳6～8個小孔，使體系內的積水散失，每24 h測定雙孢蘑菇的感官評分及腐爛指數，測定5 d。

1.3.3.1 感官評分的測定

參照石啟龍[13]的感官評價標準，結合本實驗中雙孢蘑菇的特點制定感官評價標準評定。由受過專業培訓的10人對雙孢蘑菇子實體的色澤、組織形態和滋味、氣味進行評定(表1)。

表1 雙孢蘑菇感官評定標準Table 1 Evaluation criteria for the sensual sense of mushroom

1.3.3.2 腐爛指數測定

參照楊燕婷[14]的方法，并稍作修改(表2)。

表2 腐爛指數等級劃分表Table 2 Rating index ranking table

續表2

級數腐爛程度4級腐爛部分為1/4～1/25級腐爛部分為1/2～3/46級全部腐爛

1.3.4 低溫貯藏試驗

選用篩選出的最優保鮮濃度對雙孢蘑菇進行噴涂處理，完成后通風20 min，轉移至低溫(4±1)℃、RH 80%～90%條件下存放，每隔24 h測定雙孢蘑菇的感官評分，失重率、菌落總數、可溶性蛋白含量、PPO活性，測定5 d。

1.3.4.1 感官評分測定

參照1.3.3.1的方法進行評定。

1.3.4.2 失重率測定

參照王靖博[15]的方法采用稱重法計算失重率。

1.3.4.3 菌落總數測定

采用棉拭取樣法，無菌條件下，在子實體表面取3個約1 cm2大小的區域，將滅菌棉簽用無菌水稍沾濕，在子實體每個選定區域揩抹多次，隨后將棉簽立即剪斷，投入10 mL無菌生理鹽水中振蕩培養(120 r/min、37 ℃、30 min)，制備10-1菌懸液，參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》[16]測定子實體表面菌落總數。

1.3.4.4 可溶性蛋白測定

參照鄧麗莉[17]的方法，以牛血清蛋白測定標準曲線。取1.0 g樣品加入2.0 mL生理鹽水，加入一定量4 ℃預冷的石英砂冰浴條件下研磨勻漿，經4 ℃、10 000 g離心20 min后，取上清液即為粗蛋白液，然后采用考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白含量，單位為mg/g，重復3次。

1.3.4.5 PPO活性測定

參照曹健康[18]的方法測定PPO活性

酶液制備：稱取1 g樣品，置于研缽中，加入1 mL提取緩沖液，在冰浴條件下研磨成勻漿，于4 ℃、12 000 r/min離心30 min，收集上清液即為酶提取液，0～4 ℃保存備用。

活性測定：在試管中加入4 mL質量濃度50 mmol/L、pH值5.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液和1.0 mL質量濃度50 mmol/L鄰苯二酚溶液，最后加入100 μL酶提取液，同時立即開始計時。將反應混合液倒入比色杯中，置于分光光度計樣品室中，以蒸餾水為參比，在反應15 s時開始記錄反應體系在波長420 nm處吸光度值，作為初始值，然后每隔1 min記錄1次，連續測定，重復3次。以每克香菇樣品每分鐘吸光度變化值增加1為1個活性單位，單位是ΔOD420/(min·g)。

1.3.5 數據處理

采用Excel 2010統計數據，所有數據為3次重復試驗所得，計算平均值和標準誤差，并繪制圖表；采用SPSS 18.0對數據進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 常溫下抗菌肽最優保鮮濃度篩選

由表3可知，雙孢蘑菇菇體在常溫貯藏過程中隨著時間的延長發生感官品質的劣變及腐爛變質。貯藏期內，雙孢蘑菇的感官評分不斷下降，腐爛指數不斷升高。對照組在貯藏第4天時有大部分菌傘發黏，出現了嚴重的開傘，傘面出現大量褐斑，菌柄腐爛現象，感官評分及腐爛指數達到了50.33分和68.44%，已經失去了一定的商品價值。但經1∶1(V∶V)抗菌肽P-2噴涂處理的子實體在貯藏第5天時感官評分仍為61.67分，腐爛指數為65.27%，均顯著優于同期其他處理組(P<0.05)。可見，1∶1(V∶V)抗菌肽處理是抗菌肽P-2保鮮雙孢蘑菇的最優濃度，可有效延緩雙孢菇貯藏過程中的腐爛變質，延長食用菌的保質期。

表3 常溫下抗菌肽P-2對雙孢蘑菇菇體感官評分及腐爛指數的影響Table 3 Effect of P-2 antibacterial peptide on sensory score and decay index of Mushrooms at room temperature

注：不同小寫字母代表在同一時間不同處理間的差異性。

2.2 最優濃度低溫貯藏結果分析

2.2.1 低溫下抗菌肽P-2對雙孢蘑菇感官評分的影響

感官評分是最能直觀反映食用菌貯藏期間品質變化的指標。由圖1可知，雙孢蘑菇的感官評分隨著貯藏時間的延長呈不斷下降的趨勢，且經抗菌肽P-2處理過的食用菌的感官評分高于同期對照組食用菌。雙孢蘑菇在貯藏5d時，對照組感官評分為72.90分，還具有一定的商品價值，顯著高于常溫貯藏同期的感官評分(P<0.05)，說明低溫貯藏已經有效地延緩了雙孢蘑菇的腐敗變質。而經過抗菌肽P-2處理的雙孢蘑菇的感官評分達到了78.90分，由此可見，低溫條件下結合抗菌肽P-2處理雙孢蘑菇有效地延緩了雙孢蘑菇的感官品質的下降。

圖1 低溫下抗菌肽P-2對雙孢蘑菇感官評分的影響Fig.1 Effect of antimicrobial peptide P-2 on sensory score of mushrooms at low temperature

2.2.2 低溫下抗菌肽P-2對雙孢蘑菇菌落總數的影響

鮮菇在保鮮貯藏時，往往因微生物的活動而發生腐敗變質[19]。菌落總數的多少間接反映了食用菌品質的好壞。由圖2可知，在整個貯藏期間，對照組和處理組雙孢蘑菇的菌落總數隨著時間的延長呈不斷上升趨勢，而經1∶1稀釋度抗菌肽處理后的雙孢蘑菇菌落總數顯著低于對照組(P<0.05)。這可能是由于抗菌肽具有廣譜的抑菌性，抑制了貯藏期間部分微生物的生長繁殖[20]。

圖2 低溫下抗菌肽P-2對雙孢蘑菇菌落總數的影響Fig.2 Effect of antibacterial peptide P-2 on colony count of mushrooms at low temperature

2.2.3 低溫下抗菌肽P-2對雙孢菇失重率的影響

新鮮采摘的雙孢蘑菇的含水量較高，達90%以上，在貯藏期間其水分含量因子實體表面發生蒸騰作用而散失，失重現象會引起雙孢蘑菇軟化、衰老等癥狀,導致其鮮度下降[21]。SINGH[22]等研究表明，采后新鮮雙孢蘑菇失重率在6%以上時，品質會變壞，影響其商業價值。低溫條件下抗菌肽P-2對雙孢蘑菇失重率的影響見圖3，可知貯藏期抗菌肽P-2處理過的雙孢蘑菇失重率顯著低于對照組(P<0.05)，貯藏第5天，處理組的失重率比對照組低了0.251%，這可能是由于抗菌肽噴涂處理抑制了表面微生物的滋生，延緩了菇體內營養物質和水分的流失，降低了雙孢蘑菇的失重率[23]。由此可見，低溫條件結合抗菌肽P-2處理可顯著減緩新鮮雙孢蘑菇的失重。

圖3 低溫下抗菌肽P-2對雙孢蘑菇失重率的影響Fig.3 Effect of antibacterial peptide P-2 at low temperature on weightlessness rate of mushrooms

2.2.4 低溫下抗菌肽P-2對雙孢蘑菇可溶性蛋白含量的影響

可溶性蛋白質參與果蔬多種生理生化代謝過程的調控，是果蔬品質和營養的重要指標之一[24]。其含量的下降被認為是采后果蔬衰老的一個重要特征，隨著貯藏時間的延長，由于缺乏氮源和菇體內蛋白酶活力的增強，加速了蛋白質的分解作用，從而改變了菇體的風味[25]。由圖4可知，雙孢蘑菇的可溶性蛋白含量隨著貯藏時間的延長總體呈不斷下降趨勢，而對照組在貯藏5 d時較4 d略有上升，這可能是因為貯藏后期對照組菇體代謝旺盛，產生了大量保護類的酶系，使蛋白含量略有升高[26]。經1∶1(V∶V)抗菌肽處理后的雙孢蘑菇可溶性蛋白含量顯著高于貯藏同期對照組，且較對照組下降趨勢緩慢，處理組在貯藏5 d時可溶性蛋白含量仍維持在最初貯藏時的95%以上，這可能是因為抗菌肽P-2抑制了菇體微生物的大量生長，在低溫條件下延緩了菇體的衰老，維持了膜脂系統的完整，降低了蛋白酶活力，維持了穩定的可溶性蛋白含量[27]。

圖4 低溫下抗菌肽P-2對雙孢蘑菇可溶性蛋白含量的影響Fig.4 Effect of antimicrobial peptide P-2 on soluble protein content of mushrooms at low temperature

2.2.5 低溫下抗菌肽P-2對雙孢蘑菇PPO活性的影響

多酚氧化酶是食用菌酶促褐變的主要酶類，可以使產品褐變甚至敗壞，嚴重損害食用菌的營養價值、風味及外觀質感[28]。PPO活性越低說明耐貯性能越好，低溫下抗菌肽P-2對雙孢蘑菇PPO活性的影響見圖5，隨著貯藏時間的延長，處理組與對照組的多酚氧化酶活性呈不斷上升的趨勢，且經過抗菌肽P-2處理后的雙孢蘑菇多酚氧化酶活性受到一定的抑制，這可能是由于抗菌肽抑制了雙孢菇菇體微生物的滋生，延緩了菇體的衰老和呼吸代謝，保持了脂膜系統的完整性，從而抑制了雙孢蘑菇菇體內PPO活性，延緩了雙孢蘑菇的褐變[29]。由此可見，低溫條件下抗菌肽P-2處理可抑制雙孢菇菇體PPO活性的增加。

圖5 低溫下抗菌肽P-2對雙孢蘑菇PPO活性的影響Fig.5 Effect of antibacterial peptide P-2 on PPO activity of mushrooms at low temperature

3 討論

微生物污染食用菌后，借助體內的各種生物酶分解食用菌中的糖類、蛋白質和脂肪等營養物質,使食用菌感官性狀惡化，營養價值降低，甚至腐敗變質[30]。因此，如何抑制雙孢蘑菇貯藏期間微生物的生長繁殖，對于延長雙孢蘑菇的保質期，保持雙孢蘑菇的營養品質具有重要的意義。而生物來源的抗菌肽作為一種安全、無毒副作用、抗菌譜廣、高效殺菌的天然防腐劑，具有潛在的應用價值[31]。低溫條件下食用菌呼吸作用減弱，產熱量較少，且低溫條件下抑制微生物活動，使得貯藏時間延長[32]。本研究結合這2種保鮮方法貯藏雙孢蘑菇，以期解決因微生物生長繁殖導致的雙孢蘑菇子實體腐敗變質問題，延長食用菌的保質期。

采后生理變化和微生物的生長繁殖是導致雙孢蘑菇腐敗變質的主要原因[2]。試驗結果表明短小芽孢菌HN-10抗菌肽P-2處理雙孢蘑菇可顯著抑制貯藏期間菌落總數(P<0.05)，抑制了微生物的生長繁殖，這是由于抗菌肽具有良好的抑菌性[5]。采后雙孢菇的失重主要來自于失水和營養物質的損失，失水是由于表層缺乏有效防止水分散失的組織結構，在蒸騰作用的影響下水分散失很快，而部分營養物質的損失是由于微生物的分解[33]。本研究中抗菌肽P-2處理顯著降低了雙孢蘑菇的失重(P<0.05)，貯藏5 d時，對照組和處理組失重率分別為2.884%和2.391%，這是由于抗菌肽的抑菌性使菇體微生物數量減少，降低了營養物質的損失。而雙孢蘑菇子實體潔白，菇體極易褐變，出現褐斑，是影響雙孢菇商品價值的主要問題[34]，因此抑制菇體內多酚氧化酶的活性是解決食用菌褐變問題的關鍵。本試驗結果表明，抗菌肽P-2處理后的雙孢蘑菇菇體內PPO活性與對照組差異顯著(P<0.05)，貯藏同期PPO的活性較對照組較低，從而抑制了雙孢蘑菇的褐變。總體來說，抗菌肽P-2噴涂處理雙孢蘑菇，抑制了菇體的失重和多酚氧化酶的活性，維持較高的可溶性蛋白含量，主要是由于抗菌肽的抑菌性，抑制了菇體微生物的滋生，減少了微生物對營養物質的分解，同時保持了脂膜系統的完整，抑制了多酚氧化酶的活性，延緩了雙孢蘑菇的褐變，使雙孢蘑菇保持一定的感官品質。

短小芽孢菌HN-10抗菌肽P-2作為一種新型保鮮劑，對雙孢蘑菇保鮮具有一定的應用價值。然而，抗菌肽如何影響食用菌的采后生理，在理論上還缺乏深入的認識，其作用機理有待進一步探究；并且抗菌肽的應用還是存在一定未知的安全性問題，其應用于食用菌保鮮的安全性仍需繼續研究證實。

4 結論

本試驗以感官評分和腐爛指數為指標，利用常溫(25±1)℃貯藏試驗篩選短小芽孢菌HN-10抗菌肽P-2適于雙孢蘑菇保鮮的最優稀釋濃度，并評價了最優保鮮濃度噴涂雙孢蘑菇在低溫(4±1)℃貯藏條件下感官品質、菌落總數、失重率、可溶性蛋白含量、多酚氧化酶活性等生理生化指標，結果表明：

(1)常溫(25±1)℃條件下抗菌肽P-2保鮮雙孢蘑菇的最優稀釋濃度為1∶1(V/V)，能夠顯著減緩雙孢蘑菇感官品質的下降及腐爛變質。

(2)低溫(4±1)℃條件下抗菌肽P-2能顯著抑制雙孢蘑菇的腐爛及褐變，延緩失重率和菌落總數的上升，維持穩定的可溶性蛋白質含量，有效抑制PPO的活性，有效延長雙孢蘑菇的保質期。