液液萃取結合氣質聯用技術測定山藥酒中萜烯類化合物

王晨慧，李春揚,2，張曉磊,2*，饒靜,2，辛鵬,2，尹建軍,2，宋全厚,2

1(中國食品發酵工業研究院有限公司，北京，100015) 2(國家食品質量監督檢驗中心，北京，100015)

山藥酒是以山藥為主要原料，經糖化、發酵、浸泡等工藝釀制而成的飲料酒，因具有滋養強壯，助消化，斂虛汗，止瀉之保健功效，日漸成為消費者喜愛的酒種[1]。萜類化合物是天然產物中的一類重要的次生代謝產物，由甲戊二羥酸衍生而成，結構復雜多變，分子式為異戊二烯單位倍數((C5H8)n)的烴類及其含氧衍生物，依據分子結構中異戊二烯單元的數目不同分為不同類型，如：(C5H8)1為半萜類，(C5H8)2為單萜類，(C5H8)3為倍半萜類等，它們多以游離態存在，部分以糖、酯或內酯形式存在于生物體中，具有抗腫瘤、消炎、降血脂等功效，萜類化合物也是山藥中的生物活性成分，經發酵而成的山藥酒，可最大程度的保留其功效[2]。目前，國內外對萜烯類化合物的研究主要集中于白酒[3-4]、葡萄酒[5-6]、蘋果酒[7]中，采用固相萃取(SPE)、固相微萃取(SPME)等前處理技術與氣相色譜質譜(GC-MS)或氣相色譜串聯質譜(GC-MS-MS)相結合，可實現對萜烯類化合物的分析定量。

山藥酒作為我國特有的新興酒種，其萜烯類化合物的測定技術尚屬空白。本研究以不同工藝制備的山藥酒種為分析對象，針對其基質復雜及風味物質干擾等難題，優化建立了山藥酒中萜烯類化合物的分析技術，并采用這一技術探索不同山藥酒中萜烯類化合物組成特征，為深入研究山藥酒的保健功效，提升產品品質，提供技術手段和數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山藥原酒(1)，山藥露酒(2～7),山藥黃酒(8～9)：河南焦作。

葉綠醇(純度≥98%)：南京羅奇特生物科技有限公司;香茅醇(純度≥95%)、ɑ-松油醇(純度≥97%)、芳樟醇(純度≥98%)：百靈威科技有限公司;長葉松烯(純度≥83.1%)、(-)-龍腦(純度≥98%)、橙花叔醇(純度≥98.5%)、合金歡醇(純度≥97%)、2,4-癸二烯醛(純度≥90%)、角鯊烯(純度≥98%)、p-傘花烴(純度≥98%，內標)、甲醇(色譜純)、正戊烷(色譜純)、乙醚(分析純，純度≥98%)：上海安譜實驗科技股份有限公司;NaCl、二氯甲烷、無水硫酸鈉：分析純，北京化工試劑廠。

1.2 儀器與設備

島津GC/MS-QP2010 Plus氣相色譜-質譜聯用儀(配備AOC5000自動進樣器),日本島津公司;Milli-Q Reference超純水系統,美國Millipore公司;85 μm PA聚丙烯酸酯微萃取頭,美國Supelco公司;INNOWAX色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 mm),美國HEWLETT PACKARD公司。

1.3 方法

1.3.1 頂空固相微萃取(HS-SPME)條件[8]

稱取4 g NaCl于事先放置玻璃轉子的頂空瓶中，加入10 mL已稀釋至10%(體積分數)的酒樣，將固相微萃取萃取頭插入已平衡15 min的頂空瓶，在40 ℃磁力攪拌水浴鍋內保溫萃取45 min，隨后將萃取頭取出，直接供GC/MS分析。

1.3.2 同時蒸餾萃取(SDE)條件[9]

量取50 mL酒樣于SDE裝置右側圓底燒瓶中，加250 mL蒸餾水，左側接入裝有50 mL二氯甲烷的圓底燒瓶，保持兩側微沸萃取8 h，冷卻并收集有機相過無水硫酸鈉脫水，氮吹至1 mL供GC-MS分析。

1.3.3 液液萃取(LLE)條件[4]

量取50 mL酒樣并將酒精度稀釋至10%，加NaCl至飽和，再用50mL、50 mL、30 mL正戊烷∶乙醚[V(正戊烷)∶V(乙醚)=1∶1]萃取3次，萃取液中加入50 mL超純水，用Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液調節水相pH為10，有機相過無水硫酸鈉后氮吹濃縮至5 mL。

依次用50 mL甲醇、50 mL乙醚和50 mL正戊烷預淋洗硅膠柱(20 cm×2 cm)。將濃縮后的有機相加入硅膠柱中，以流速1 mL/min依次用50 mL重蒸戊烷(F1)，50 mL重蒸的戊烷∶乙醚(體積比分別為80∶20，F2；50∶50，F3)， 50 mL甲醇(F4)洗脫得到4個組分(控制洗脫流速在1～1.5 mL/min)。收集各組分，氮吹濃縮至200 μL，待GC-MS分析。

1.3.4 GC-MS條件

色譜條件：所用色譜柱為HP-INNOWAX(30 m×0.25 mm，0.25 mm)，柱溫采用程序升溫，初溫35 ℃，保持2 min后以2 ℃/min升至90 ℃，再以5 ℃/min升至200 ℃，保持10 min后以6 ℃/min升至230 ℃，保持10 min。進樣口溫度250 ℃，不分流進樣1 min，載氣為氦氣。

質譜條件：MS電離方式為EI，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，質譜掃描范圍35～350 amu，質譜分析所用數據庫為NIST14庫。

1.3.5 標準溶液的配制

稱取萜烯類標準品10 mg(精確至0.01 mg)至10 mL容量瓶中，以正戊烷溶解并定容，配制成質量濃度為1. 0 mg/mL的萜烯類化合物標準儲備液，再逐級稀釋至一系列質量濃度梯度的混合標準溶液，每一質量濃度梯度的混合標準溶液中加入5 μL終質量濃度為0.533 mg/L的p-傘花烴為內標。

2 結果與分析

2.1 分析方法的選擇和優化

萜類化合物在植物中一般以結合態和游離態存在，部分游離態化合物含量較低，加之山藥酒酒精度較高，醇酯類揮發性化合物種類多，因此必須選擇適當的樣品前處理方法結合靈敏度較高的儀器分析技術，才能實現準確分析的目標[10]。本實驗選擇HS-SPME、SDE、LLE三種前處理方法進行優選，這也是酒中揮發性成分測定較多采用的3種經典方式，并結合GC-MS條件的優化，建立山藥酒中痕量萜類化合物的的分析技術。

分別對3種方法提取的樣品液進行GC-MS分析，根據可定性組分數量進行比較。圖1為頂空固相微萃取(a)、同時蒸餾萃取(b)、液液萃取F1組分(c)及F3組分(d)的總離子流圖，采用HS-SPME、SDE、LLE 3種方式分別鑒定出4種、7種和10種萜烯類化合物，采用LLE具有較好的效果。

圖1 不同方法比較GC-MS總離子流圖Fig.1 Comparison of GC-MS total ion chromatograms by different methods

其中，采用HS-SPME萃取方式，酒中大量酯類和醇類等含量較高的組分極易被吸附，導致痕量萜類組分被包在這些組分內，響應值低，較難定性；同時蒸餾萃取法是通過同時加熱樣品液與有機溶劑至沸騰來實現目標成分的富集、濃縮，由于制備過程中長時間加熱，造成小分子萜烯的揮發和氧化，減少了這些成分的檢出率；而LLE方式，萜類化合物在飽和食鹽水中溶解度較低，易被有機試劑萃取，利用正相色譜技術將萃取液按極性大小洗脫，分段收集，從而減少損失，最大限度提取目標化合物，因此本實驗采用這一方式對山藥酒中萜類痕量成分進行提取。

參照FAN等[11]的實驗方法，對提取溶劑種類、洗脫液配比進行選擇和優化，并根據組分分離效果對程序升溫條件進行優化，結果表明通過V(正戊烷)∶V(乙醚)=1∶1萃取后,經溶劑洗脫實現了山藥酒中10種萜類化合物的準確定性定量，萜類化合物主要集中在F1(反式橙花叔醇、長葉松烯、芳樟醇、香茅醇)、F3組分(角鯊烯、(-)-龍腦、植醇、合金歡醇)中，F2(反式，反式-2,4-癸二烯醛)和F4組分(α-松油醇)各檢測到1種萜類成分。

2.2 山藥酒中萜烯類化合物定量方法評估

通過線性范圍及相關系數、檢出限和定量限以及相對標準偏差和回收率，對方法進行綜合評估，結果見表1。

表1 10種萜類化合物的方法學評估結果Table1 Methodological evaluation results of 10 terpenoids

注：f表示作標準曲線所取的點數。

其中，各萜烯類化合物標準曲線線性范圍在11.9～30 390.2 μg/L，相關系數R2均大于0.993 6，具有較好的線性；分別以信噪比為3和信噪比為10時的質量濃度作為檢出限和定量限，其檢出限為0.56～26.96 μg/L，定量限為1.86～89.88 μg/L；分別采用該方法對樣品平行測定6次計算其相對標準偏差，在0.4%～1.7%之間；通過添加近等量的標準品，平行測定6次，加標回收率在92.68%～103.21%。上述結果顯示該方法靈敏度高，結果準確可靠，可滿足山藥酒中痕量萜烯類化合物定量分析要求。

2.3 山藥酒中萜烯類化合物組成及保健功效

分別對山藥原酒(1)、山藥露酒(2～7)、山藥黃酒(8～9)中萜烯類化合物進行分析，其化合物類別和含量詳見表2。

從萜烯類化合物組成看，3個類別山藥酒中共鑒定出10種萜烯類化合物，包括5種單萜類化合物，分別為芳樟醇、香茅醇、反式2,4-癸二烯醛、(-)-龍腦和α-松油醇、3種倍半萜烯類化合物為橙花叔醇、長葉烯與合金歡醇，1種二萜類化合物葉綠醇，1種三萜類化合物角鯊烯，其中山藥原酒和露酒均檢出10種萜烯類化合物，而山藥黃酒未檢出合金歡醇。這3類山藥酒其原料均產自河南焦作，盡管釀造工藝不同，但所含萜類化合物種類相近，表明其原料產地對山藥酒中萜烯類組成具有一定的影響。

從萜烯類化合物含量來看，各山藥酒均存在差異，萜烯類化合物總量最高的是山藥原酒，為293.24 μg/L，其中萜烯烴含量為36.168 μg/L，萜烯氧化物含量為257.072 μg/L；山藥露酒中萜烯類總量在42.266～183.253 μg/L，多為萜烯氧化物；山藥黃酒萜烯類化合物總量相近，但組成差異較大，其中8#樣品以萜烯烴類化合物為主，含量為112.75 μg/L，樣品9中則主要是萜烯類氧化物，達到總量的90.97%。結果表明，不同加工工藝對山藥酒中萜類化合物的含量產生一定影響。

表2 山藥酒中萜烯類化合物測定結果Table 2 Determination results of terpenes in yam wine

注：n.d.表示沒有檢測到；

從單個萜烯的含量來看，長葉松烯(平均含量7.968 μg/L)、角鯊烯(平均含量15.513 μg/L)、龍腦(平均含量33.341 μg/L)和香茅醇(平均含量36.408 μg/L)在不同工藝的山藥酒中含量均較高，特別是龍腦，在山藥原酒中其質量濃度達到100.164 μg/L，占萜烯類總量的34.16%。除上述物質，植醇和合金歡醇在山藥原酒中含量較高，質量濃度分別為77.81 μg/L和29.74 μg/L；山藥露酒含有較為豐富的是葉綠醇(平均含量49.175 μg/L)，山藥黃酒中α-松油醇在萜類總量中也占有較大比例，達到8.3%。

山藥酒中這些萜烯類化合物不僅具有獨特的香味，還具有一定的保健功能，如龍腦具有類似樟腦和松木的氣息[12]。據藥典(2015)記載，龍腦常用量為0.3～0.9 g，主治開竅醒腦、清熱解毒等；吳娟等[13]通過大鼠尾靜脈注射15 μg/g即可促進血腦屏障通透性；長葉松烯，給人以精神振奮之感，并有抗菌、消毒的功效[14]；姜文廣等[15]闡述了芳樟醇是合成維生素E的重要中間體，具有鎮痛、抗焦慮、鎮靜催眠、抗炎、抗腫瘤、抗菌等藥理活性，其中BATISTA[16]采用口服方式給予小鼠芳樟醇(5～100 μg/g)可達到鎮痛作用；國外相關文獻發現橙花叔醇、角鯊烯具有抗腫瘤和免疫調節等活性[17-20]。目前，萜類化合物多種功效的作用機制有待進一步明確，對這些功效成分的剖析，將有助于山藥酒這一新興酒種的深度開發與研究。

3 結論

本實驗針對山藥酒特點，通過實驗條件的選擇、優化，建立了液液萃取結合氣相色譜質譜聯用技術對山藥酒中萜烯類化合物的分析方法，實現對10種萜類化合物的準確定量，包含5種單萜類化合物，3種倍半萜烯類化合物，以及二萜類化合物及三萜類化合物各1種，對此方法進行評估，其相關系數R2≥0.993 6，檢出限為0.56～26.96 μg/L，定量限為1.86～89.88 μg/L，相對標準偏差小于1.7%，加標回收率為92.68%～103.21%，表明該方法靈敏度高，結果準確可靠，可滿足山藥酒中痕量萜烯類化合物定量分析要求。采用這一技術對市售山藥原酒、山藥露酒和山藥黃酒進行分析，其萜烯類化合物組成相近，但含量存在差異，表明原料產地與加工工藝對萜類化合物的構成具有一定的影響；從組成結構看，長葉松烯、角鯊烯、龍腦和香茅醇在不同山藥酒中含量均較高，這些萜烯類賦予了山藥酒獨特的風味及保健功效，對其進行深入研究，將有助于山藥酒的品質提升與深度開發。