四氫姜黃素對H22腹水瘤模型小鼠的防治作用

俞斐 章浙忠 陳琳 魯遙

作者單位：310000 浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院

原發(fā)性肝癌（primary liver cancer，PLC）是臨床上最為常見的消化道惡性腫瘤之一，起病隱匿，病死率高，在腫瘤致死原因中位居第二位［1］。絕大數(shù)患者確診時已為中晚期，從而失去了外科手術治療的機會而采用化療，但不良反應較多［2］。姜黃素（CUR）自從被報道具有抗癌活性以來，廣泛受到國內(nèi)外學者的關注。現(xiàn)代藥理研究表明，CUR可抑制癌細胞的生長，在腫瘤的治療方面，CUR的作用顯著。但由于其水溶性和穩(wěn)定性差，在腸道易發(fā)生葡萄糖醛酸轉移酶介導的Ⅱ型代謝，口服后在體內(nèi)代謝快，血藥濃度較低，生物利用度差，嚴重地限制了其臨床應用［3］。四氫姜黃素（THC）作為姜黃素的體內(nèi)代謝產(chǎn)物，本實驗對THC進行抗腫瘤活性評價及其初步的機制探討，為更好的開發(fā)和利用姜黃素類化合物的藥用價值提供實驗依據(jù)和研究基礎。

1 材料與方法

1.1 動物及肝癌細胞株 健康雄性昆明KM小鼠90只，體質量（20±2）g，浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供；小鼠腹水型H22肝癌細胞株購于中國科學院上海細胞庫。

1.2 主要試劑與儀器 THC購于國藥集團化學試劑有限公司；環(huán)磷酰胺（CTX）購于上海國藥控股有限公司；冰醋酸、Tween-80購于廣東光華化學廠有限公司；蛋白定量試劑盒購于上海貝博生物科技有限公司。AR1140電子天平（美國奧豪斯公司）；SW-CJ-1F超凈工作臺（蘇凈集團安泰公司）；DHG-9023A電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）。

1.3 方法 （1）藥物劑量設計：本節(jié)實驗研宄中（除了用以初步探討作用機制的H22腹水瘤小鼠模型），雄性KM小鼠被隨機分成6組，每組各10只。所有小鼠在實驗前適應性飼養(yǎng)7d。正常組（Intact）和模型組（Vehicle）給予預防藥物的相應溶劑（0.5%Tween-80），預防給藥組小鼠給予低、中、高劑量的THC（5、10、20mg/kg）、環(huán)磷酰胺（CTX，30mg/kg），按0.1ml/10g體重給藥1次/d，連續(xù)給藥7d。（2）小鼠造模：將H22腹水瘤細胞凍存管從液氮罐中取出，置于37℃的溫水中使其融化，然后用吸管吸取適量細胞懸液至離心管內(nèi)，加入10倍量無菌PBS緩沖液，混勻后于臺式離心機中離心5min（1000r/min），棄去上清液，收集H22細胞，重復清洗操作三次；之后用無菌PBS緩沖液調整為1×107/ml的細胞懸液，取100μl置于1ml EP管內(nèi)，向其中加入等體積的0.4%臺盼藍染液，混勻后通過顯微鏡觀察，利用臺盼藍拒染法進行細胞計數(shù)，觀察H22細胞的存活率。經(jīng)觀察后計算，細胞存活率＞96%。隨后向每只小鼠腹腔注射H22細胞懸液0.2ml復制H22腹水瘤小鼠模型（相當于瘤細胞數(shù)2×106/只），正常組除外。

1.4 H22腹水瘤模型小鼠生存周期實驗 小鼠腹水瘤造模成功24 h后，將KM小鼠隨機分為6組：空白對照組，模型對照組，陽性對照（CTX）組，THC低、中、高劑量組，每組各10只，除陽性對照（CTX）組腹腔注射（0.1ml/10g）給藥外，其余各組灌胃給藥1次/d，連續(xù)7d，每日觀察各組小鼠生活、飲食情況以及毛色等外觀狀況，統(tǒng)計各組小鼠的生存周期，比較各組之間的差異。

1.5 細胞計數(shù)分析儀檢測細胞活力與Western Blot檢測蛋白表達 鼠腹水瘤造模成功24h后，將KM小鼠隨機分為3組：模型對照組、陽性對照（CTX）組和THC（20mg/kg）組，每組各10只，除陽性對照（CTX）組腹腔注射給藥外，其余各組灌胃給藥，按0.1ml/10g體重給藥1次/d，連續(xù)給藥7d。每次灌胃前，測量統(tǒng)計各小組的體重。末次給藥1h后，脫頸處死各組小鼠，用無菌注射器抽取每只小鼠的腹水，取200μl用PBS緩沖鹽溶液處理后，立即檢測其細胞活力（全自動細胞計數(shù)分析儀），另外腹水收集后采用Western Blot檢測H22腹水瘤細胞中的Bax、Bcl-2的蛋白表達水平。取各組小鼠的胸腺和脾臟組織，精密稱重后記錄各組小鼠的免疫臟器重量。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，各組間的差異比較采用方差分析（One-way ANOVA），實驗結果以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 THC對H22腹水瘤模型小鼠生存周期的影響 THC對H22腹水瘤小鼠生存周期的影響如圖1所示，在接種H22腹水瘤細胞4～5 d后，各組小鼠飲食和活動均開始減少，腹部開始出現(xiàn)膨脹，喜歡群居和蜷臥，體重也明顯增加。與模型組相比，THC（5、10、20mg/kg）給藥組能延長小鼠的生存周期，平均生存時間隨著給藥劑量的升高而提高，且與模型組差異顯著（THC低劑量組：P＜0.05，其余各組：P＜0.001），結果提示，THC能顯著延長小鼠的生存周期。因此，在后續(xù)實驗中，選取THC的高劑量組（20 mg/kg）對H22腹水瘤小鼠模型進行初步的機制探討。

圖1 THC對H22腹水瘤模型小鼠生存周期的影響（n=10，?P＜0.05，#P＜0.001）

2.2 THC對H22腹水瘤模型小鼠體重及腹水瘤細胞活力的影響 如圖2、3所示，給小鼠接種H22腹水瘤細胞后，小鼠的體重顯著上升，與模型組小鼠相比，THC在第5天后能明顯抑制小鼠的體重（5～7d，P＜0.001）；與模型組相比，THC治療后H22腹水瘤細胞活力顯著下降（P＜0.001），提示THC對小鼠惡性腹水有抑制作用。

圖2 THC對H22腹水瘤模型小鼠體重的影響

圖3 THC對H22腹水瘤細胞活力的影響（n=10，?P＜0.05，???P＜0.001）

2.3 THC對H22腹水瘤模型小鼠免疫器官的影響 THC對腹水瘤小鼠免疫臟器的影響如圖4所示，由圖可知與空白組小鼠相比，接種H22腹水瘤細胞后小鼠的免疫器官無明顯影響，而在給予THC干預后，小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)也均無明顯變化，表明給予THC后對小鼠的免疫器官無明顯影響；相反，給予陽性藥CTX治療后，小鼠的脾臟指數(shù)（P＜0.001）和胸腺指數(shù)（P＜0.001）均顯著下降，表明陽性藥CTX可能對小鼠的免疫器官有毒副作用。

2.4 THC對H22腹水瘤模型小鼠Bax、Bcl-2蛋白表達水平的影響 THC對腹水瘤小鼠Bax、Bcl-2蛋白表達的影響如圖5所示，在分析統(tǒng)計各組小鼠條帶的灰度值后發(fā)現(xiàn)，THC給藥組與模型組小鼠相比能顯著提高Bax的蛋白表達（均P＜0.01）和抑制Bcl-2的蛋白表達含量（均P＜0.01），提示THC可能參與了Bcl-2介導的線粒體凋亡通路并能改善Bcl-2體系的蛋白表達。

圖4 THC對H22腹水瘤模型小鼠免疫器官的影響（n=10，?P＜0.001）

圖5 THC對H22腹水瘤模型小鼠Bax、Bcl-2蛋白表達水平的影響（n=3，?P＜0.01）

3 討論

在H22腹水瘤模型小鼠生存周期實驗中，THC能顯著延長小鼠的生存周期。而在后面對各組小鼠的體重、細胞活力和免疫器官指數(shù)進行統(tǒng)計分析的時候發(fā)現(xiàn)，THC能有效抑制腹水瘤小鼠體重，抑制小鼠腹水細胞的活力，與陽性藥CTX相比THC不影響小鼠體內(nèi)的免疫器官，提示THC基本無毒副作用。因此在后續(xù)的實驗中，初步探究THC對H22腹水瘤模型小鼠的作用機制。

細胞的增殖和凋亡的動態(tài)平衡與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。許多蛋白在細胞凋亡的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的作用［4］。Bcl2家族蛋白是細胞內(nèi)一組結構上同源功能上相關的蛋白。主要分為兩大類：一類是抑制細胞凋亡，如Bcl2、Bcl-xl等；另一類是促進細胞凋亡，如Bax、Bcl-xs等。其中Bcl2、Bax的表達為代表。Bcl2和Bax蛋白水平表達的高低，與細胞凋亡直接相關。Bax和Bcl-2通過形成同源或異源二聚體來調節(jié)細胞凋亡，當Bax形成同源二聚體時誘導細胞凋亡；Bax與Bcl-2形成異源二聚體時則實現(xiàn)了Bcl-2抑制細胞凋亡的功能。這與本實驗研究中發(fā)現(xiàn)THC給藥組與模型組小鼠相比能顯著提高Bax的蛋白表達（均P＜0.01）和抑制Bcl-2的蛋白表達含量（均P＜0.01）的結果類似。更多的臨床研究表明，多種不同類型的腫瘤均出現(xiàn)了Bax蛋白水平表達下降，Bcl2表達升高的現(xiàn)象，其兩者比例決定了細胞凋亡的走向。若Bcl-2/Bax比例增高，則抑制細胞凋亡，反之，則促進細胞凋亡［5］。

在本實驗H22腹水瘤模型小鼠的實驗研究中發(fā)現(xiàn)THC能提高腹水瘤小鼠的生活質量和生存周期，降低小鼠的體重和腹水量。進一步的機制研究表明THC能夠通過上調Bax蛋白水平，下調Bcl-2蛋白水平，提示THC可通過調節(jié)凋亡相關蛋白而抑制H22腹水瘤的生長，從而為四氫姜黃素的進一步研究提供理論基礎。