陰溝腸桿菌產β-內酰胺酶和質粒介導耐藥基因的檢測及耐藥性分析

王勇 王雪芬 卜勁松 章旺 徐丁

作者單位：312300 浙江省紹興市上虞人民醫院

陰溝腸桿菌是醫院感染常見的條件致病菌之一，因抗菌藥物的長期不合理應用，常對多種抗菌藥物耐藥，造成臨床治療困難。其耐藥機制主要包括產生超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs）、產AmpCβ-內酰胺酶（AmpC）、喹諾酮類（qnr）基因介導耐藥、整合子、主動外排泵系統作用、藥物作用靶位的改變、外膜通透性改變等［1］。本實驗通過對陰溝腸桿菌產酶及耐藥基因檢測進行研究，旨在為指導臨床合理選用抗生素及控制耐藥菌株在醫院內的傳播提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 菌株來源 收集本院臨床分離去除同一病例同一部位的陰溝腸桿菌共89株。菌株采用法國生物梅里埃公司的VITEK-2 Compact進行鑒定。質控菌株大腸埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603購自中國食品藥品檢定研究院。

1.2 儀器與試劑 藥敏紙片：亞胺培南（IPM，10μg/片）、頭孢他啶（CAZ，30μg/片）、頭孢吡肟（FEP，30μg/片）、頭孢噻肟（CTX，30μg/片）、頭孢西丁（FOX，30μg/片）、頭孢噻肟/克拉維酸（CTX/CA，30/10μg/片）和頭孢他啶/克拉維酸（CAZ/CA，30/10μg/片）均購自英國OXOID公司。細菌質粒DNA提取試劑盒購自北京天根。引物參考李美［2］的文獻由上海Invitrogen公司合成，PCR擴增儀和凝膠成像分析系統為美國BIO-RAD公司產品。

1.3 方法 （1）陰溝腸桿菌產不同表型ESBLs酶和AmpC的檢測：依據明德松［3］建立的多底物協同-拮抗法（MSSAT），一步檢測出產ESBLs、不同型AmpC酶及二者不同組合產酶情況。（2）陰溝腸桿菌耐藥基因檢測：按照質粒提取試劑盒的操作步驟提取陰溝腸桿菌質粒DNA，采用PCR法擴增ESBLs基因（TEM-1、SHV-12、SFO-1、VEB-3、CTX-M）、AmpC酶基因（ACT-1、DHA-1）和qnr基因（qnrA、qnrB、qnrS）。煮沸法制備PCR模板，反應體系為：總體積均為50μl：ddH2O 25μl、Premix ExTaq 20μl、10μmmoL/L上、下游引物各1.5μl、模板DNA 2μl。熱循環參數：94℃預變性5 min，94℃變性50s，SHV-12 53℃退火 50s；CTX-M 55℃退火 50s；VEB-3、qnrB 56℃退火 50s；TEM-1、SFO-1、DHA-1、qnrA、qnrS 57℃退火50s；ACT-1 59℃退火50s；30個循環后，72℃最后延伸10min。PCR 擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳后觀察結果，抽取各陽性標本PCR擴增產物送上海Invitrogen 公司進行測序，應用GenBank在線數據庫對比工具BLAST進行序列比對分析。

2 結果

2.1 陰溝腸桿菌對14種抗生素的耐藥率 89株陰溝腸桿菌對14種常見抗菌藥物的藥敏試驗結果，見表1。

表1 陰溝腸桿菌對14種抗生素的耐藥率（%）

2.2 陰溝腸桿菌ESBLs和AmpC酶表型檢測結果 89株陰溝腸桿菌中，單產ESBLs13株（14.61%，13/89），單產AmpC酶41株（46.07%，41/89），同時產ESBLs和 AmpC酶 24株（26.97%，24/89）， 不 產 酶 11株（12.36%，11/89）。

2.3 陰溝腸桿菌質粒介導耐藥基因檢測結果 （1）β-內酰胺酶基因檢測結果：89株陰溝腸桿菌共測出43株攜帶β-內酰胺酶基因，其中含一種β-內酰胺酶基因的有18株，其余25株均含兩種或兩種以上β-內酰胺酶基因。43株β-內酰胺酶基因檢出菌中，ESBLs基因檢出率為38.20%（34/89），AmpC酶基因檢出率為19.10%（17/89），見表2。（2）qnr基因檢測結果：89株陰溝腸桿菌檢出qnr基因陽性有11株（12.36%，11/89），其中5株（5.62%，5/89）qnrA基因陽性；4株（4.49%，4/89）qnrB基因陽性；2株（2.25%，2/89）qnrS基因陽性。（3）β-內酰胺酶表型與基因型檢測結果：通過MSSAT法檢測出的37株ESBLs表型陽性菌中有30株攜帶ESBLs耐藥基因；65株AmpC酶表型陽性菌中有15株攜帶AmpC酶耐藥基因。

表2 89株陰溝腸桿菌中β-內酰胺酶基因的分布情況

3 討論

研究顯示，鈍化酶或滅活酶的產生、質粒和整合子等可移動基因元件參與的耐藥、qnr基因介導的耐藥、外膜通透性下降、主動外排泵增強、生物被膜的形成等是引起陰溝腸桿菌耐藥的主要機制，其中以細菌產β-內酰胺酶所占的比重較大［4］。近年來，因為廣譜抗生素的廣泛使用，陰溝腸桿菌對抗菌藥物的耐藥性不斷增強，其多重耐藥（MDR）甚至泛耐藥（PDR）不斷被發現。本資料藥敏試驗結果顯示，陰溝腸桿菌對青霉素類（氨卡西林）、一代頭孢（頭孢唑啉）耐藥率最高，對碳青霉烯類（亞胺培南、厄他培南）、氨基糖苷類（阿米卡星）、喹諾酮類（左氧氟沙星、環丙沙星）、四代頭孢（頭孢吡肟）藥物耐藥率較低，整體耐藥情況尚好，未發現較嚴重的抗菌藥物耐藥現象，說明本院對臨床抗生素的合理使用、規范管理工作較好，杜絕了由于完全經驗用藥、濫用藥物而造成的細菌耐藥率提高。

有研究發現，ESBLs和AmpC 酶是陰溝腸桿菌對β-內酰胺類藥物產生耐藥的主要機制［5］。ESBLs主要由質粒介導，能水解廣譜青霉素、單環類抗生素、β-內酰胺酶及第三代頭孢類，但對碳青霉烯類、頭霉素及酶抑制劑敏感。AmpC 酶主要由染色體介導，屬Ambler分類中C類酶，Bush分類中I類酶，其水解底物比ESBLs更廣泛，可水解多種三代頭孢菌素類抗菌藥，且不受酶抑制劑所抑制，極易造成續發耐藥［6］。作者采用MSSAT法一步同時檢測ESBLs、AmpC酶的不同表型，其結果顯示，89株陰溝腸桿菌中，單產AmpC酶占46.07%，同時產ESBLs和AmpC酶占26.97%，低于楊洪芬［7］的52.87%，31.03%，高于吳財銘［8］的40.2%，17.1%、蘇國娟［9］的19.74%，14.47%。PCR結果顯示，ESBLs基因檢出率為38.20%，以TEM-1型為主，低于李美［2］的57.47%，高于王鳳霞［10］的15.79%，且均以TEM-1型為主；AmpC酶基因檢出率為19.10%，均低于上述報道。以上結果，一方面說明陰溝腸桿菌產ESBLs酶和AmpC酶的情況在不同地區、不同醫院間存在顯著差異，而產生這些差異的原因多樣化，比如和細菌存活環境、醫院用藥習慣、患者感染情況、醫院感染、消毒措施等有關；另一方面可能與相互之間檢測的基因類型不同有一定的關系。同時，通過對β-內酰胺酶的表型、基因型檢測結果的比較發現，在37株ESBLs陽性菌中有30株攜帶ESBLs基因，未檢測出的7株菌株所攜帶ESBLs基因可能是本試驗未檢測的；同時有4株菌檢測出ESBLs基因型呈陽性而表型卻呈陰性，這可能是因為細菌酶產量低致使MSSAT法無法檢測出或者作者采用的MSSAT法是一步檢測ESBLs和AmpC酶，藥物紙片之間可能存在一定的干擾而影響到檢出，需要后續研究進一步探討。在65株AmpC酶陽性菌中僅有15株檢測到質粒型AmpC酶基因，大部分AmpC酶基因未檢測到的原因一方面可能與作者檢測的是質粒型的AmpC酶基因，而AmpC酶只有少部分由質粒介導有關，另一方面也可能因為本試驗未檢測的AmpC酶基因型的存在；另外有2株菌AmpC酶基因型呈陽性而表型呈陰性，也可能與待檢菌產酶量低有關。

近年發現，質粒上攜帶的qnr基因可介導喹諾酮類藥物的耐藥。qnr基因的作用機制為表達細菌DNA解旋酶保護蛋白，從而拮抗喹諾酮類藥物的作用，而喹諾酮類藥物正是通過作用于解旋酶而達到殺菌的作用［11］。質粒介導的qnr基因具有水平傳播性，可以跨種傳播，導致耐藥擴散。本實驗共檢測出質粒介導qnr基因陽性菌株11株，qnrA、qnrB、qnrS基因檢出率分別為5.62%、4.49%、2.25%，均低于李美［2］、張偉紅［12］等的報道，這可能和每個地區臨床抗菌藥物使用習慣等有關。在實驗中作者發現攜帶qnr基因的菌株均呈MDR現象，其對14種抗菌藥物的耐藥率高達75%以上。考慮這是因為在qnr基因存在時，發生不同喹諾酮類耐藥機制的累加效應，被認為對抗菌藥物低水平耐藥能使細菌在次級突變出現的基礎上達到高水平耐藥［13］。同時，在11株qnr基因陽性菌株中，在產ESBLs和（或）AmpC酶菌株中檢出的有9株，說明qnr基因主要存在于產ESBLs和（或）AmpC 酶的菌株中，且其和細菌的多MDR有較大的關聯。

綜上所述，陰溝腸桿菌耐藥機制復雜，抗耐藥形勢嚴峻。在臨床抗感染治療中，應考慮產ESBLs和AmpC酶陰溝腸桿菌有可能存在的MDR問題，同時對qnr基因介導的喹諾酮類藥物耐藥也應引起足夠的重視。醫院應規范抗菌藥物的使用和管理，嚴格按照藥敏試驗結果合理使用抗菌藥物，同時加強臨床耐藥菌株監測，避免經驗用藥、濫用藥物導致耐藥菌株產生。