類志賀鄰單胞菌耐藥基因檢測與耐藥性關系的研究

楊 虹，苗鵬飛，譚淑雯，楊 映，吳勇亮，陳言峰，于 輝

( 佛山科學技術學院 生命科學與工程學院，廣東 佛山 528231 )

隨著水產養殖業的快速發展，抗生素廣泛使用及不正當使用，導致藥物殘留、細菌多重耐藥和環境污染等問題日益突出[11]。類志賀鄰單胞菌作為水產動物消化道炎癥的新病原之一，給水產養殖業造成了巨大的經濟損失。通過加強類志賀鄰單胞菌的耐藥基因檢測，進一步研究其耐藥機制成為目前防治類志賀鄰單胞菌的重要手段。筆者對從臨床分離到的55株類志賀鄰單胞菌進行耐藥基因檢測，并對抗生素藥物的耐藥性與相應耐藥基因關系進行分析，從而對類志賀鄰單胞菌的耐藥水平做出更精準客觀的評價，以期為類志賀鄰單胞菌的預防和治療及其多重耐藥機制的進一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

試驗用55株類志賀鄰單胞菌分離株，分離自廣東省佛山市順德區和南海區，中山市等地區患病的鱖魚(Sinipercachuatsi)、加州鱸(Micropterussalmoides)和烏鱧(Ophiocephalusargus)，由本實驗室鑒定并保存。

1.2 主要試驗試劑

營養瓊脂培養基(廣東環凱微生物科技有限公司)；腦心浸液肉湯培養基(中國青島高科園海博生物技術有限公司)；抗生素藥敏紙片(杭州微生物試劑有限公司)；細菌基因組DNA抽提試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]；2×EasyTaq PCR SuperMix(北京全式金生物技術有限公司)；DNA Marker[寶生物工程(大連)有限公司]；瓊脂糖(深圳市普博科技有限公司)。

1.3 菌株培養與藥敏試驗

無菌條件下，挑取類志賀鄰單胞菌菌株于營養肉湯培養基中，28 ℃恒溫搖床120 r/min振蕩培養24 h后，采用麥氏比濁法調整類志賀鄰單胞菌菌液濁度為0.5麥氏比濁管濁度。采用K-B紙片擴散法進行藥敏試驗，測定抑菌圈大小，藥敏結果以美國臨床實驗室標準委員會標準為判斷標準。在無菌條件下用棉拭子蘸取已純化的含有類志賀鄰單胞菌的菌液，均勻地涂布于普通瓊脂平板上，將藥敏紙片緊貼于已接種類志賀鄰單胞菌的培養基上，28 ℃恒溫培養24 h，隨后測量抑菌圈直徑的大小，根據判讀標準判別結果。

1.4 細菌DNA提取和耐藥基因檢測

按照細菌基因組DNA抽提試劑盒的操作說明提取細菌DNA，作為PCR模板，于-20 ℃保存。參照文獻[12-14]設計β-內酰胺類、喹諾酮類和四環素類耐藥基因(TEM、gyrB和tetR)引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR引物序列和產物長度見表1。PCR反應體系為20 μL：無菌超純水10 μL，2×EasyTaq PCR SuperMix 7 μL，上、下游引物各1 μL，細菌DNA模板1 μL。PCR反應條件為：94 ℃，3 min；94 ℃，30 s； 53 ℃，30 s；72，1 min； 72 ℃，5 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

表1 耐藥基因引物序列

2 結 果

2.1 類志賀鄰單胞菌的耐藥性

所分離到的類志賀鄰單胞菌對30種抗生素藥物均產生不同程度的耐藥性(表2～表3)，其中對克林霉素、萬古霉素、氨芐西林、麥迪霉素、羧芐西林、苯唑西林等6種抗生素藥物的耐藥性較高，耐藥率分別為98.2%、98.2%、90.9%、89.1%、89.1%和87.3%；對卡那霉素、丁胺卡那、哌拉西林、諾氟沙星、四環素、頭孢拉定、頭孢氨芐等多種抗生素藥物的敏感和耐藥性具有明顯的菌株差異；而對頭孢唑啉、頭孢曲松、頭孢他啶、多黏菌素B、氧氟沙星、米諾環素和頭孢呋辛等則高度敏感。值得注意的是，全部的類志賀鄰單胞菌均表現為嚴重的多重耐藥，其中有1株高達18重耐藥，最少的也對5種抗生素耐藥，多重耐藥率為100%。

表2 55株類志賀鄰單胞菌的藥敏性

續表2

抗生素種類敏感率/%中介率/%耐藥率/%陽性菌株數百分比/%喹諾酮類諾氟沙星65.510.923.6氧氟沙星81.814.63.6環丙沙星56.42023.6哌拉西林30.912049.11323.64氨基糖苷類卡那霉素41.836.421.8丁胺卡那74.67.318.2慶大霉素70.912.716.4新霉素69.12010.91730.91大環內酯類麥迪霉素010.989.1紅霉素5.527.367.34887.28多肽類萬古霉素01.898.25396.36黏菌素類多黏菌素B90.95.53.623.64硝基呋喃類呋喃唑酮96.41.81.811.82磺胺類復方新諾明16.49.174.54174.54林可霉素類克林霉素1.82098.25498.18

注：至少對1種抗生素產生耐藥的菌株即為陽性菌株.

表3 類志賀鄰單胞菌多重耐藥檢出率

2.2 類志賀鄰單胞菌耐藥基因的檢測

TEM、gyrB和tetR基因的PCR擴增結果見圖1，檢測目的片段大小與預期結果一致。檢測結果顯示(表4)，55株菌株中10株攜帶TEM基因，37株攜帶gyrB基因以及20株攜帶tetR基因，攜帶率分別為18.2%、67.3%和36.6%；還有16株未檢測到上述3種耐藥基因。另外，攜帶1種耐藥基因的有18株，占耐藥菌株的46.2%；攜帶2種和3種耐藥基因的分別占到耐藥菌株的38.5%和15.4%。

圖1 TEM、gyrB、tetR基因PCR電泳圖M：DL2000 DNA Marker；1～3：TEM基因；4～6：gyrB基因；7～9：tetR基因；10：陰性對照.

耐藥基因菌株數檢出率/%TEM1018.2gyrB3767.3tetR2036.6TEM+gyrB916.4TEM+tetR610.9gyrB+tetR1832.7TEM+tetR+gyrB610.9無1629.1

通過對55株類志賀鄰單胞菌的耐藥基因與耐藥表型檢測結果比較發現，所檢測的菌株對β-內酰胺類和四環素類的耐藥基因與耐藥表型的符合率分別18.18%和100%。然而，藥敏結果顯示，類志賀鄰單胞菌對喹諾酮類抗生素十分敏感，但gyrB基因的檢出率卻很高，耐藥菌株的耐藥基因和耐藥表型之間存在較大的差異。

3 討 論

本研究所檢測的55株類志賀鄰單胞菌對30種抗生素藥物均有一定程度的耐藥，其中對克林霉素、萬古霉素、氨芐西林、麥迪霉素、羧芐西林、苯唑西林等抗生素具有很強的耐受力，臨床治療類志賀鄰單胞菌感染要盡量減少使用這些抗生素。對頭孢唑啉、頭孢曲松、頭孢他啶、多黏菌素B、氧氟沙星、米諾環素、頭孢呋辛等抗生素則高度敏感，對卡那霉素、丁胺卡那、哌拉西林、諾氟沙星、四環素、頭孢拉定、頭孢氨芐等敏感性次之，表明類志賀鄰單胞菌對這幾種抗生素并未產生嚴重的耐藥性，在臨床防治類志賀鄰單胞菌感染中可以使用，但是要避免單一使用導致類志賀鄰單胞菌耐藥性變異。此外，藥敏試驗結果顯示，類志賀鄰單胞菌最低的也達到了5重耐藥，最多的達18重耐藥，提示類志賀鄰單胞菌存在嚴重的多重耐藥，應該引起重視。同時，藥敏試驗結果與已報道分離的類志賀鄰單胞菌不盡一致[14-17]，應該是與地域分布、環境因素差異、不同宿主以及養殖者使用抗生素的習慣不同等有關。因此在該病害的防治過程中，更應參照分離株的藥敏試驗結果，科學合理地使用抗生素，才能達到有效治療的目的。

β-內酰胺類抗生素是最早、最廣泛使用的一類抗生素。由質粒介導的超廣譜β-內酰胺酶對菌體內的窄譜和廣譜頭孢菌素、單環類抗生素及G-桿菌青霉素等抗生素有較好的破壞作用。有研究證實，質粒介導的β-內酰胺酶產生的耐藥菌，其耐藥性大多是在接觸抗生素后獲得的，并通過耐藥基因在同種或異種菌株間轉移或傳播，使得更多的細菌產生耐藥性[18]。本試驗分離到的菌株對氨芐西林、羧芐西林、苯唑西林等抗生素耐藥，但TEM基因的檢出率較低，耐藥菌株可能存在其他未檢測耐藥基因以及不同的耐藥機制。因此，臨床治療應該謹慎使用各類抗生素，防止細菌攜帶的耐藥基因被大量誘導表達，導致多重耐藥。

喹諾酮類抗生素的使用量僅次于β-內酰胺類。喹諾酮類抗生素對革蘭氏陰性菌的主要作用靶位點是DNA旋轉酶，而gyrB正是編碼DNA旋轉酶B亞單位蛋白的基因[19]。gyrB基因的突變會引起靶位酶的改變，使得喹諾酮類抗生素不能正常與DNA旋轉酶正常結合，因而不能阻止細菌DNA復制，從而產生耐藥。本研究的55株菌株中，gyrB基因的攜帶率為67.3%，而且特異性條帶明亮，但大部分菌株對諾氟沙星、環丙沙星等耐藥性很低，耐藥表型與耐藥基因之間存在較大的差異，說明類志賀鄰單胞菌菌株存在潛在的耐藥性，可能與耐藥基因的誘導性表達，或者耐藥基因不表達或表達不完全相關。

四環素類抗生素的耐藥機制主要為核糖體保護機制和藥物外運機制，而tetR基因調控核糖體蛋白及參與藥物外運的外運蛋白基因的轉錄和表達，且具有高度特異性和保守性[20]。當細菌的生存環境中沒有四環素類藥物或者其衍生物的存在時，tetR基因會與結構基因的啟動子tetO結合，從而抑制四環素類耐藥基因的表達；一旦四環素類藥物進入細菌細胞后，便會與tetR結合致其構型發生改變，使其從tetO序列上解離下來，隨之激活了四環素類耐藥基因的表達[21]。本試驗所檢測的55株類志賀鄰單胞菌中tetR基因的攜帶率較低，藥敏試驗結果顯示，類志賀鄰單胞菌對四環素、多西環素、米諾環素等耐藥性也偏低，說明tetR基因的攜帶情況與耐藥菌株的四環素耐藥表型存在一定的相關性。

細菌耐藥性與其本身特性、耐藥性基因的傳播以及地域、藥物使用情況等因素有很大的關系。養殖水環境中和動物體內殘留的抗生素對水產動物養殖帶來了嚴重的不良影響。絕大多數細菌的耐藥性是通過耐藥基因產生、獲得和表達來實現[22]。當抗生素殘留，可以誘導細菌耐藥性產生、耐藥基因水平擴散或垂直傳播，導致該菌對抗生素的耐藥性增強，加大了該菌治療的難度。近年來，減少進而阻止細菌耐藥的傳遞成為廣受養殖戶關注的問題。本試驗結果表明，類志賀鄰單胞菌耐藥基因和耐藥表型尚未完全對應，有些菌株已檢測到耐藥基因，但未表現出相關耐藥性；有些菌株則未檢測到相應的耐藥基因，卻表現出較強的耐藥性。因此，亟需進一步深入研究類志賀鄰單胞菌的耐藥機制，為防止類志賀鄰單胞菌耐藥性的產生和傳播以及魚病的治療提供理論依據。