對抗生素注射劑一致性評價/再評價的思考

胡昌勤

(中國食品藥品檢定研究院，北京 102629)

2015年8月18日，國務院印發的《關于改革藥品醫療器械審評審批制度的意見》，將“提高仿制藥質量，加快仿制藥質量一致性評價”作為改革藥品審評審批制度的5大目標之一；以2016年3月5日國務院辦公廳發布的《關于開展仿制藥質量和療效一致性評價的意見》為節點，國內以生物等效為目標的口服制劑一致性評價工作蓬勃開展； 2017年12月CED一致性評價辦公室又發布了《已上市化學仿制藥(注射劑)一致性評價技術要求(征求意見稿)》，揭開了注射劑仿制藥一致性評價的大幕。抗生素藥物在注射劑中所占的比例較大，我們曾對國內市場抗生素藥品的質量現狀進行過分析，探討國產仿制藥與原研藥品的主要質量差距[1]，本文針對抗生素注射劑的特點，進一步探討抗生素注射劑一致性評價中的關鍵點及評價策略。

1 注射劑一致性評價的主要關注點

據文獻報道[2]，日本有17.2%的醫生和37.2%的患者不愿意使用仿制藥，其原因主要與療效和安全性的差異有關，如仿制的萬古霉素和替考拉寧注射劑，其在實際治療中抗菌活性較原研產品分別低于14.6%和17.3%。因此，保證仿制藥與原研制劑在治療中具有相同的有效性和安全性是仿制藥一致性評價應重點解決的問題。

對口服制劑，目前人們普遍將生物等效性作為評價仿制藥與參比制劑是否具有臨床一致性的關鍵指標。但對于注射劑，特別是水溶性注射劑，其生物等效性不是影響臨床等效的主要原因，有哪些關鍵因素可能影響國產抗生素注射劑的臨床一致性呢？

抗生素藥物按其結構通常分為β-內酰胺類(包括青霉素與頭孢菌素)、氨基糖苷類、大環內酯類、喹諾酮類、糖肽類等，評價抗生素類藥物臨床有效性的最理想參數是PK/PD(pharmacokinetic/pharmacodynamic)。由于不同類抗生素的抗菌作用機理不同，用于評價臨床有效性的關鍵PK/PD參數也不相同。對β-內酰胺類抗生素，藥物在體液中有效血藥濃度(Ceff)的持續時間(T＞MIC)是最關鍵參數；對氨基糖苷類抗生素和喹諾酮類抗生素，24h體內的AUC/MIC比值是最關鍵參數；而對大環內脂類和糖肽類等非濃度依賴性抗生素，如阿奇霉素和萬古霉素等，AUC/MIC比值是最關鍵參數[3]。

Schito等[4]利用數學模擬的方法對多家注射用頭孢曲松鈉仿制藥與原研制劑羅氏芬?(Rocephin?)在胸腔積液的有效游離藥物濃度(Ceff)進行了預測，認為只有羅氏芬的Ceff可達到要求的濃度范圍。國內臨床反映，國產注射用頭孢曲松鈉較羅氏芬?起效約慢30～40min；由于頭孢曲松鈉為高血清蛋白結合藥物，未成鹽的頭孢曲松酸較頭孢曲松鈉具有更高的蛋白結合率，而早期國產的頭孢曲松鈉成鹽率相對較低，因此，與血清蛋白具有較高的蛋白結合率，導致早期國產仿制品在給藥初期游離的藥物濃度達不到Ceff，進而使得其起效時間延長[5]。

注射用美羅培南為美羅培南與碳酸鈉的混粉。Agudelo等[6]利用豚鼠感染模型等證明，雖然仿制和原研注射用美羅培南在動物體內為生物等效，但部分仿制品的抗感染效果不如原研制劑；其原因是由于體內的腎毒性肽酶(DHP-I)對部分仿制藥較原研制劑具有更強的水解能力。提示在臨床應用中仿制藥和原研注射用美羅培南可能出現不等效現象。由于國內注射用美羅培南仿制藥和原研藥的主要差異為產品中碳酸鈉含量的不同，表現為仿制藥溶液的pH明顯高于原研制劑[7]，這種差異是否會影響體內DHP-I酶的活性值得探討。

利用GastroPlus軟件，以萬古霉素B為對象建立藥代動力學模型，我們曾模擬多次給藥條件下注射用鹽酸萬古霉素的人體內血藥濃度曲線。結果顯示，規格為500mg的注射用鹽酸萬古霉素，靜脈滴注(給藥時間為1h，間隔6h給藥)，健康成年男性體內的萬古霉素血藥谷濃度均達不到《中國萬古霉素治療藥物監測指南》中推薦的10mg/L谷濃度；提示規格為500mg制劑藥物劑量偏低。比較仿制藥與原研制劑的裝量，發現規格為500mg的原研制劑實際是按標示量的110%～115%投料，通常較國產制劑的裝量約高13%[8]；此外，由于萬古霉素來源于生物發酵，產品中的小組分/雜質可以與萬古霉素B競爭結合萬古霉素靶位，導致療效降低[9]；而目前國產注射用鹽酸萬古霉素中萬古霉素B的含量約較原研產品約低2%～3%[8]；綜上，注射用萬古霉素由于裝量及萬古霉素B純度的差異可導致國產仿制藥較原研制劑的活性低約15%。

而對于多組分抗生素如慶大霉素、替考拉寧等，不同的組分對特定致病菌可能表現出不同的抗菌活性[10]。由于多組分抗生素的組分差異是客觀存在的，當仿制藥與參比制劑的組分比例不相同時，可能導致在特定的動物抗感染模型中表現出不同的抗感染效果[11]，雖然其提示在對特定的病人治療時候，可能出現療效不一致現象；但這種差異可能在治療其它致病菌的感染時呈現出完全不同的治療效果。因此從整體角度，對多組分抗生素，僅依據個別致病菌建立的動物抗感染模型，比較仿制藥與參比制劑的療效一致性是不夠嚴謹的。

對注射劑臨床一致性評價的另一關注點是藥物的安全性。原研注射用頭孢孟多酯鈉產品為頭孢孟多酯鈉與5%碳酸鈉的混粉，而國內的仿制品中大多不含碳酸鈉。注射用頭孢孟多酯鈉中加入適量的碳酸鈉可以明顯改善貯存過程中樣品溶液的澄清度易變渾濁這一現象[12]；而樣品溶液的澄清度與藥物的不良反應例數呈正相關，即不含碳酸鈉的注射用頭孢孟多酯鈉較含5%碳酸鈉的制劑的總不良反應例數更高，即含5%碳酸鈉的注射用頭孢孟多酯鈉的安全性更高[13]。

綜上，從臨床應用的有效性與安全性出發，評價仿制藥與參比制劑(原研制劑)工藝、處方差異的影響應是注射劑一致性評價的關鍵。

2 注射劑一致性評價與新仿制藥研發策略的異同

仿制藥一致性評價是對已上市的藥品與參比制劑的臨床療效差異進行評價，通過處方/工藝等的改進等，使得產品的療效與參比制劑一致。和藥物研發中的新藥仿制相比，雖然在研發/評價過程中都要從安全、有效、質量3方面與參比制劑進行比較， 但由于仿制藥一致性評價是對“現實藥品”的評估，而藥品仿制是對“未來藥品”的期望，因此，實現相同目標所采用的策略應不完全相同(圖1)。不同于新仿制藥通常需借助于“反向過程”的結果進行處方/工藝設計，國產仿制藥的療效與質量評價通常已經有大量的數據可以查閱，特別是歷年的國家評價性抽驗數據，其中蘊藏著大量的質量信息；一些被認為與原研藥品處方、工藝有明顯差異的品種，基本已進行過對比研究。因此，在進行仿制藥一致性評價時，應首先通過對文獻的調研，發現國產仿制藥與參比制劑的關鍵質量差異，進而針對性的進行改進，而不應將精力主要放在與參比制劑的質量對比上。

案例1：注射用頭孢曲松鈉：頭孢曲松鈉(ceftriaxone sodiμm)為瑞士Roche公司在20世紀80年代研制的第三代頭孢菌素，為結晶性粉末。其通過無菌分裝工藝生產注射用頭孢曲松鈉，即制劑的質量主要取決于原料的質量。1991年頭孢曲松鈉及制劑在國內仿制成功。國內臨床曾反映國產注射用頭孢曲松鈉較原研藥品起效約慢30～40min。 2018年、2019年和2011年，中國食品藥品檢定研究院(以下簡稱中檢院)對該品種曾組織過3次國家評價性抽驗，發現國產頭孢曲松鈉的突出質量問題為溶液的澄清度差。據文獻報道，國產頭孢曲松鈉的溶液澄清度[14-15]，有關物質[15]，成鹽率[5]等方面與原研羅氏芬均存在差異, 成鹽率偏低可導致頭孢曲松鈉具有更強的血清白蛋白結合率，可能導致給藥初期血漿中的游離藥物濃度偏低，影響藥品的起效速率[5]。

頭孢曲松鈉分子含兩個鈉離子，3.5個水分子(圖2a)，濕品中頭孢曲松含量的理論值為83.5%，水分子的理論值為9.52%；按無水物計，頭孢曲松鈉中頭孢曲松含量的理論值為95.7%。頭孢曲松鈉結晶工藝的差異可導致產品成鹽率偏低[16]，進而使其與血漿蛋白的結合率增加，給藥初期的游離藥物濃度偏低，導致起效慢。采用粉末X射線衍射技術結合聚類分析手段，薛晶等[17]將頭孢曲松鈉的晶體特征分為不同的亞型，原研羅氏芬樣品屬第Ⅱ亞型；通過比較不同亞型樣品的成鹽率、水分等與結晶工藝相關的指標, 并比較加速實驗過程中不同亞型樣品晶格穩定性的差異與藥用丁基膠塞相容性的差異，證明提高國產頭孢曲松鈉產品質量的關鍵應從控制產品的結晶工藝入手，保證終產品為第Ⅱ亞型的樣品。

圖1 仿制藥一致性評價與新藥仿制策略的比較Fig.1 Strategy comparison between quality consistency evaluation of marketing drug and new generic drug R&D

圖2 國內不同企業注射用頭孢曲松鈉的質量對比Fig.2 Quality comparison of ceftriaxone sodiμm for injection in different domestic manufacture

對2009年的評價性抽驗數據進行分析(圖2b、圖2c)。雖然全部產品均符合中國藥典的規定，但不同企業產品的頭孢曲松濕品含量和水分含量差異明顯，且部分企業產品的批間差異較大，提示企業對產品的工藝控制能力較差；進一步分析發現，國產制劑的水分含量明顯低于理論值(9.52%)，且多數低于羅氏的產品(9.1%)，提示部分產品中結晶水不足；濕品中頭孢曲松的含量偏高，部分高于理論值(83.5%)，提示部分產品存在成鹽不完全現象；而上述差異又均與頭孢曲松鈉的結晶過程有關(未發表資料)。即提示頭孢曲松鈉的晶體特征是關鍵質量屬性，對原料結晶工藝的控制是關鍵質控點。

綜上所述，在對注射用頭孢曲松鈉進行一致性評價時，應以原料的結晶工藝及工藝控制為切入點，首先證明結晶工藝可以保證產品的晶體特征屬于第Ⅱ亞型，再以產品濕品的頭孢曲松含量和水分含量為指標對工藝過程進行優化，保證生產過程的一致性，降低批間差異。

3 注射劑一致性評價/再評價之一般策略

質量源于設計(QbD)理念在藥品研發、生產、監管等領域已經被普遍接受。通常目標產品的質量可通過產品的關鍵質量屬性(CQAs)進行表征[18-19]。因此，在進行仿制藥一致性評價中，應首先對參比制劑的CQAs有深入的理解，在此基礎上確定參比制劑生產過程中的關鍵原輔料屬性(CMAs)和關鍵工藝參數(CPPs)，建立CMAs 、CPPs和產品CQAs的關系。這不僅有助于揭示仿制藥與參比制劑的主要質量差異，且可以針對性的對仿制藥的處方、工藝進行評價；并通過對仿制藥CMAs和CPPs的控制，實現對產品CQAs的控制，保證仿制藥與參比制劑的一致性。只有當確認仿制藥與參比制劑的CQAs基本一致時，對二者的藥學指標進行系統的比較才有意義(圖3)。

發現藥品關鍵質量屬性并與生產工藝相關聯通常可以采用以下方法。

圖3 進行仿制藥一致性評價的一般策略Fig.3 General strategy for quality consistency evaluation of generic drug

3.1 利于國家評價性抽驗數據結合文獻進行分析

2015年，中檢院通過對從2008年起歷年國家評價性抽驗涉及的15個注射用頭孢菌素質量的系統回顧性分析[20]，認為市場上注射用頭孢菌素的突出質量問題是“溶液的澄清度與顏色”。通過對2008—2013年國家藥品不良反應監測數據庫的檢索，將注射用頭孢菌素的主要不良反應(ADR)報告與市場抽驗結果相關聯，發現注射用頭孢曲松鈉和注射用頭孢唑林鈉的嚴重不良反應比率在2011年后呈下降趨勢，與二者在2010年后溶液的澄清度問題明顯好轉有直接相關。將“溶液的澄清度”作為CQAs，發現頭孢菌素原料與膠塞的相容性直接影響注射劑的澄清度；使用鍍膜/覆膜膠塞或選用質量較好的頭孢菌素原料可以有效地阻斷膠塞揮發物與頭孢菌素的相互作用，改善頭孢菌素與膠塞的相容性；而頭孢菌素原料的結晶工藝是影響原料質量的關鍵工藝，優化CPPs是獲得理想頭孢菌素原料的關鍵，這也是目前國產仿制藥與原研藥品之間的最大差異。

對頭孢菌素晶型、工藝與穩定性關系的研究揭示，頭孢菌素可以形成不同晶型的晶體，也可以與水分子或溶劑相互作用形成不同的水合物或溶劑化物，通常具有不同空間結構的晶體(晶型/水合物)的固體穩定性不同[21-25]。如頭孢哌酮鈉具有A、B兩種晶型，A晶型為三斜晶系，B晶型為單斜晶系；A晶型較B晶型更穩定。根據粉末X-衍射圖譜特征衍射峰(峰位置、峰強度)的差異，A晶型樣品又可分為多個亞晶型，亞晶型Ⅰ和亞晶型II在加速試驗中表現出更高的穩定性，原研藥品“先鋒必”和“舒普深”中的頭孢哌酮鈉即為此亞晶型[23]。頭孢米諾鈉晶體含有7個水分子，根據單晶X-衍射結果，理想狀態下每一晶格中含3個游離態的水分子和4個通過氫鍵與頭孢米諾結合的水分子；但水分子在晶格中可以存在于多個位置，導致不同的結晶條件下可形成不同的亞晶型，在粉末X-衍射圖譜中表現出細微的差異；不同亞晶型的頭孢米諾鈉樣品具有不同的化學穩定性[25]。同樣，頭孢他啶含有5分子結晶水，不同工藝的頭孢他啶產品在TGA中表現出不同的失水特性，提示其晶體中結晶水的穩定狀態不同，這種差異使其在加速實驗中表現出色澤變化速率的不同；而注射用頭孢噻肟鈉晶體結晶度的差異是影響其穩定性的主要因素(未發表資料)。

上述結果提示，合理利用國家評價性抽驗數據是發現國產制劑與參比制劑質量差異的有效途徑。

3.2 根據雜質譜進行分析

2009年，中檢院在國家評價性抽驗中對不同成鹽工藝的國產注射用阿奇霉素的雜質譜進行了考察，發現其中的主要雜質有阿奇霉素-N-氧化物、3'-去克拉定糖阿奇霉素、氮紅霉素和阿奇霉素B；氮紅霉素和阿奇霉素B為工藝雜質；阿奇霉素-N-氧化物和3'-去克拉定糖阿奇霉素分別為阿奇霉素的氧化和酸降解雜質，其中3'-去克拉定糖阿奇霉素主要在成鹽過程中產生，并與成鹽劑的種類密切相關，提示注射用阿奇霉素的成鹽工藝是關鍵生產工藝；以3'-去克拉定糖阿奇霉素為指針，發現以檸檬酸(原研產品中的成鹽劑)為代表的弱酸是理想的成鹽劑，而鹽酸等強酸不易作為注射用阿奇霉素的成鹽劑[26]。

2014年，中檢院在的國家評價性抽驗中對阿莫西林克拉維酸鉀片劑的雜質譜進行了分析，在17個廠家的152批樣品中共發現有13個雜質，其中阿莫西林閉環二聚體和阿莫西林噻唑酸被認為是影響該品種關鍵質量屬性的雜質；通過對其來源和降解途徑的分析，認為生產中的關鍵工藝為制粒工藝，其中的干燥參數為關鍵工藝參數。此外，處方的合理性也是影響樣品雜質產生的關鍵因素[27]。

2017年，中檢院在的國家評價性抽驗中對頭孢拉定顆粒劑的雜質譜進行了分析，依據質量源于設計的理念，探尋其關鍵質量屬性和關鍵工藝參數。在頭孢拉定顆粒劑的特征雜質譜中有27個雜質，其中10個主要雜質的結構已經了確認，結合對不合格產品的雜質分析結果，確認生產過程中防止頭孢拉定的氧化是關鍵工藝控制點，粒制劑過程中對制粒前溫濕度的控制是工藝控制的關鍵[28]。

3.3 利于多變量數據分析方法

對某企業不同時間段生產的215批五水頭孢唑林鈉原料的28項質檢項目包括：比旋度、吸收系數、pH值、水分、有關物質(雜質A、雜質B、雜質C、雜質F、雜質G、雜質H、雜質I、雜質J、雜質K、雜質L、雜質M、雜質N、單個未知雜質、總雜質)、聚合物、殘留溶劑(N,N-二甲基乙酰胺、丙酮、異丙醇、二氯甲烷)、不溶性微粒(≥10μm不溶性微粒、≥25μm不溶性微粒)、松密度、緊密度、含量進行分析，所有產品均符合藥品質量標準的規定。將檢驗數值(質量屬性)經Z-score法標準化處理后，再利用one-way ANOVA分析，發現10項指標(比旋度、水分、雜質H、雜質I、雜質M、雜質N、總雜、丙酮、≥25μm不溶性微粒、緊密度)受批次變化(類別)的影響顯著(P值＜0.01)，認為它們可能是影響產品質量的關鍵質量屬性。通過對五水頭孢唑林鈉生產工藝的了解，上述10項指標分別與結晶過程、干燥過程和GMP廠房的潔凈度控制環節相關聯：結晶過程中的最適溫度范圍、持續時間等因素均可影響各種工藝雜質(雜質H、雜質I、雜質M和雜質N)在成品中的含量，進而影響產品的比旋度、總雜質含量等質量屬性；結晶過程中有機溶劑的添加速率和溫度等可影響晶體粒度的大小，進而影響成品的緊密度等質量屬性。即在上述的10項指標中，7項(比旋度、雜質H、雜質I、雜質M、雜質N、總雜質、緊密度)與結晶工藝息息相關，產品間丙酮和水分含量的變異與干燥工藝相關，≥25μm不溶性微粒的數目可在一定程度上反映廠房的潔凈程度。由此可知，結晶過程和干燥過程是五水頭孢唑林鈉原料藥生產的關鍵工藝。利用這10項指標通過聚類分析，產品可被劃分為不同的類；逐一分析這些指標對產品聚類結果的影響，發現比旋度可有效地反映出五水頭孢唑林鈉原料結晶工藝的變異；水分或丙酮的含量可反映干燥工藝對五水頭孢唑林鈉終產品的影響。即在上述可能影響產品質量的10個關鍵質量屬性中，比旋度、水分/丙酮可用來表征五水頭孢唑林鈉生產過程一致性的最有效指針(未發表資料)。

4 抗生素注射劑參比制劑的選擇

仿制藥一致性評價過程中，需要以參比制劑實物標準，通過質量對比研究，保證仿制藥品與參比制劑在臨床中具有相同安全性與有效性。因此，參比制劑的選擇直接影響仿制藥一致性評價工作的質量。本文通過對3個典型抗生素注射劑的分析，探討參比制劑選擇過程中的關注點。

4.1 關注原研產品處方工藝的合理性

注射用頭孢孟多酯鈉的原研產品為頭孢孟多酯鈉與5%碳酸鈉的混粉，1978年由美國禮來公司研發上市。貯存中注射用頭孢孟多酯鈉易水解產生頭孢孟多，溶解時引起溶液的pH下降，可能導致溶液變渾濁。在產品中加入碳酸鈉或氨基丁三醇可以改善溶液的渾濁[12]。國內的研究發現，含5%碳酸鈉的注射用頭孢孟多酯鈉的溶液澄清度的不合格率明顯降低，其總不良反應例數也遠低于不含碳酸鈉的注射用頭孢孟多酯鈉[13]。提示含5%碳酸鈉的混粉產品更合理，即參比制劑應選擇原研處方的注射用頭孢孟多酯鈉。

4.2 關注制藥技術的發展方向

注射用頭孢匹胺鈉原研產品系1985年在日本上市的由日本住友制藥公司與山之內制藥公司聯合開發的產品。因為當時沒能找到適宜的成鹽劑與頭孢匹胺成鹽，并獲得頭孢匹胺鈉結晶，故選用成鹽后直接凍干工藝生產；由于苯甲酸鈉作為成鹽反應的相轉移催化劑無法從產品中去除，導致終產品為頭孢匹胺鈉與一定量的苯甲酸鈉的混合物。伴隨著科學技術的進步，目前已經尋找到適宜成鹽劑，并能得到穩定的頭孢匹胺鈉晶體，使得溶媒結晶工藝成為生產頭孢匹胺鈉的主流工藝。相對于溶媒結晶工藝產品，凍干工藝的產品雜質含量偏高且穩定性較差，且由于含有一定量的苯甲酸鈉，作為靜脈給藥的注射劑使其增加了不必要的安全性風險。近10年的不良反應監測結果揭示，溶媒結晶工藝產品的總不良反應例數遠低于凍干工藝產品[29]。因此，參比制劑應選擇溶媒結晶工藝的注射用頭孢匹胺鈉，以代表當前制藥技術的發展方向。

4.3 關注產品的特殊性

注射用頭孢唑林鈉由日本藤澤藥品株式會社于1971年開發上市。為保證產品的穩定性，原研最初采用結晶脫水工藝生產：即首先結晶先得到α-頭孢唑林鈉，再減壓脫水得到脫水結晶性產品。結晶脫水工藝的生產成本較高，為降低生產成本，仿制藥多采用冷凍干燥法生產無定型頭孢唑林鈉。無定型頭孢唑林鈉與膠塞的相容性較差，導致貯存過程中產品的澄清度極易不符合中國藥典的規定[30]。伴隨著對頭孢唑林鈉水合物特性的認知，通過完善結晶工藝，控制貯運條件等措施，頭孢唑林鈉水合物(α-頭孢唑林鈉、五水頭孢唑林鈉)產品分別在日本和國內上市。頭孢唑林鈉水合物不僅在成本上明顯低于結晶脫水工藝產品，其制劑在雜質含量、與膠塞的相容性等方面均優于凍干法生產的無定型頭孢唑林鈉產品；頭孢唑林鈉水合物的嚴重不良反應的發生率也明顯較無定型產品低[20]；目前原研企業已經放棄結晶脫水工藝生產頭孢唑林鈉，而直接生產頭孢唑林鈉水合物(α-頭孢唑林鈉)。但頭孢唑林鈉水合物僅適合采用玻璃瓶包裝。對以塑料膜為包材如雙室袋等的新型制劑，由于包材的氣密性較玻璃瓶差，較難保證貯運期間頭孢唑林鈉水合物的水分子不從晶格中逸出，因此該類制劑仍需以冷凍干燥法的無定型頭孢唑林鈉為原料進行生產。即結晶工藝生產的頭孢唑林鈉水合物與冷凍干燥法生產的無定型頭孢唑林鈉對特定的制劑類型均體現出一定的優勢。對此類產品，是否需要針對不同的制劑類型選擇不同的參比制劑值得思考。

5 結論

對抗生素注射劑的一致性評價應在對仿制藥與原研藥品安全性、有效性與生產一致性(manufacturing consistency)總體評估的基礎上，企業通過對產品處方、工藝、質控水平的評估與提高，保證產品的臨床療效。多年來中檢院組織的國家評價性抽驗工作，已經積累了大量的國產仿制藥質量信息，對其進行合理的分析與利用，有利于促進一致性評價工作的開展。適宜的參比制劑的選擇直接影響一致性評價工作的質量。應以臨床指標(安全、有效)為關鍵指針，選擇處方、工藝合理、代表藥品生產發展方向的主流產品作為參比制劑，且應考慮不同制劑的特殊性。