國產鹽酸林可霉素滴眼液的質量評價

王強 李香荷 高燕霞 龐文哲

(河北省藥品檢驗研究院，石家莊 050000)

鹽酸林可霉素為林可酰胺類抗生素，臨床主要用于由革蘭陽性菌引起的各種感染。1962年，由美國人Mason在鏈霉菌林可變種培養液中獲得[1]，1975年我國開始批量生產。國內現有劑型包括：片劑、膠囊劑、注射劑、滴眼液和滴耳液。

鹽酸林可霉素滴眼液對革蘭陽性菌如葡萄球菌屬(包括耐青霉素株)，鏈球菌等有較高抗菌活性。對少數陰性菌也有良好抗菌活性。主要不良反應有：(1)皮疹、瘙癢等過敏反應；(2)過量使用并吸收可致中性粒細胞減低，血小板減低，念珠菌感染等；(3)耳鳴、眩暈等。

鹽酸林可霉素原料質量標準收載于美國藥典(USP)41、歐洲藥典(EP)9.0、BP2017和中國藥典2015年版二部；滴眼液僅中國藥典2015年版二部收載。

鹽酸林可霉素滴眼液為2017年度國家食品藥品監督管理總局的國家藥品計劃抽驗品種。本文在完成法定標準檢驗的基礎上，結合探索性研究對檢驗結果進一步分析，進而對國產鹽酸林可霉素滴眼液的質量現狀進行評價，并從安全性和有效性角度對企業生產工藝和現行法定標準提出建議。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

2DLC/LCMS-IT-TOF離子阱-飛行時間質譜儀(日本島津公司)。LC-20AT液相色譜儀(日本島津公司)。Mettler Toledo型電子天平(Mettler公司)。Mettler Seveneasy酸度計(Mettler公司)。

1.2 試藥

林可霉素對照品(批號：130432-201510,85.5%)、苯甲酸鈉對照品(批號：100433-201702,99.7%)、羥苯乙酯對照品(批號：100847-201604,99.9%)、苯扎溴銨對照品(批號：135051-201401，含苯扎溴銨10.9mg/mL)、硫柳汞鈉對照品(批號：135050-201401, 94.6%)均由中國食品藥品檢定研究院提供。丙烯基類似物和Z-異構體、α-酰胺基差向異構體林可霉素、N-去甲基林可霉素均由TLC公司提供。

試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 樣品

共抽驗鹽酸林可霉素滴眼液57批次，涉及生產企業4家，批準文號4個。抽樣覆蓋了全國21個省、自治區和直轄市。本次抽樣樣品能代表國內本品種目前的生產和使用狀況，對其進行檢驗和統計分析，結果能較好地反映目前國產鹽酸林可霉素滴眼液的質量現狀。

2 試驗方法

2.1 法定標準檢驗

按照中國藥典2015年版二部進行檢驗。

2.2 探索性研究

通過調研，了解該品種處方及生產工藝、掌握大量與本品質量相關的信息，探索性研究主要根據法定檢驗結果，圍繞藥品安全性、有效性和質量可控性開展以下研究：抑菌劑使用的合理性研究、雜質譜研究、有關物質方法修訂、抑菌劑檢測方法修訂等。上述探索性研究LC-MS/MS條件為：

一維液相條件：色譜柱為Phenomenex Luna 5u C18(4.6mm×250mm, 5μm)；柱溫：50℃；流速：1.0mL/min；進樣量：10μL；流動相：pH6.1緩沖液(取磷酸34g，溶于900mL水中，用濃氨水調節pH值至6.1，加水稀釋至1000mL)-甲醇-乙腈(77:8:15,V∶V∶V)，等度洗脫。

二維液相條件：色譜柱為Phenomenex Luna 5u C18(4.6mm×250mm, 5μm)；柱溫：50℃；流速：0.3mL/min；流動相：水-乙腈(40:60, V∶V)，等度洗脫。

質譜條件：離子源：ESI(+)；檢測器電壓：1.65kV；霧化氣：氮氣1.5L/min；干燥氣：氮氣10L/min；脫溶劑管溫度：200℃；加熱模塊溫度：200℃。

3 結果與討論

3.1 法定檢驗結果

依據中國藥典2015年版二部檢驗，57批次鹽酸林可霉素滴眼液全部合格，合格率100%。對與產品質量緊密相關的主要檢查項目如pH值、有關物質、抑菌劑、含量結果進行了統計分析。

3.1.1 pH值

57批次樣品pH值檢測結果在5.7～6.4之間，經比較，A、C、D企業樣品pH值的批間差異不大，極差為0.2，RSD為0.7%～1.4%。B企業樣品個別批次pH值與平均值偏離較大，最低pH值5.7，最高pH值6.4，平均值為6.1， RSD為2.5%，提示B企業工藝穩定性和控制水平還需要進一步提高和改進。

3.1.2 有關物質

57批次樣品中相對保留時間約為0.72的雜質為0.1%～0.4%，均未超過標準規定的0.5%，A企業樣品中2批次和D樣品3批次該雜質為0.1%，其他批次差異不大，為0.3%～0.4%。其他單個雜質為0.2%～0.4%，僅1批次(A企業樣品)最大單個雜質為0.6%，與其他批次差異較大，也導致了該批次雜質總量最高，為1.1%。其他樣品雜質總量為0.3%～0.8%。

檢測中發現，A企業樣品在主峰相對保留時間0.16和0.25處有兩個較大雜質峰(分別命名為降解雜質1和降解雜質2)，見圖1，含量分別為0.2%～0.8%和0.8%～1.1%。現行標準規定，有關物質在相對保留時間0.27之前的雜質應作為輔料扣除。采用該企業提供的輔料進樣，發現在相同保留時間處輔料峰面積遠遠小于樣品中雜質峰面積，分別為0.06%～0.1%和0.3%～0.4%。因此，上述雜質為制劑生產過程中產生，應作為有關物質雜質計算，現行標準中按輔料峰扣除，存在缺陷。

3.1.3 抑菌劑

現行標準規定了3種抑菌劑的檢驗，分別為苯甲酸鈉、苯扎溴銨與羥苯乙酯。本次抽驗樣品中共抽到D樣品5批次，羥苯乙酯含量為85.6%～102.9%。C樣品6批次，苯甲酸鈉含量為93.4%～102.1%。未抽到采用苯扎溴銨作為抑菌劑的樣品。檢驗中發現，現行標準中規定的對照品溶液的濃度和供試品溶液的濃度差異較大，對照品溶液濃度過高，易造成色譜柱過載，計算結果誤差較大，需作進一步改進。

圖1 A企業樣品有關物質典型HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatogram of the a company samples

此外，本次抽樣最多的A、B企業共46批樣品均采用硫柳汞作為防腐劑，現行標準未作檢測要求，質量不可控。相關文獻表明[2]，含汞化合物可以抑制細胞內的多種酶，特別是活性中心為巰基的酶，可以多路徑破壞細胞代謝，造成細胞嚴重損傷。A、B企業對硫柳汞的使用是否做到合理使用，需進一步研究。

3.1.4 含量測定

5 7批次樣品的含量按標示量計均在95.4%～102.8%范圍內，平均值為98.9%，總體服從正態分布。對不同企業的樣品含量測定結果進行分析，A企業平均含量為99.2%，RSD為1.7%；B企業平均含量為98.6%，RSD為1.3%；C企業平均含量為97.5%，RSD為1.0%；D企業平均含量為99.9%，RSD為2.1%；各企業樣品平均含量差異不大，D企業的數據離散程度相對較大，提示該企業的投料量穩定性欠佳。

3.2 探索性研究

通過現行標準檢驗，發現鹽酸林可霉素滴眼液在抑菌劑的使用及雜質控制方面存在較大問題。

3.2.1 抑菌劑使用的合理性研究

(1)處方合理性分析：本次抽驗涉及的4家企業使用了3種抑菌劑，分別為硫柳汞、苯甲酸鈉和羥苯乙酯，見表1。輔料包括氯化鈉(滲透壓調節)、氫氧化鈉、硼砂、磷酸二氫鈉、三乙醇胺等。分析可知，A、B企業的樣品中硫柳汞與氯化鈉存在配伍禁忌[3]，導致滴眼液中硫柳汞不穩定，降解產生雜質，存在安全隱患。C、D樣品未發現配伍禁忌。

此外，對比發現A企業處方未遵循中國藥典規定的抑菌劑選擇最低有效原則，已有文獻報道[4]，滴眼液中硫柳汞含量為0.02mg/mL時其抑菌效力即可達到藥典要求，A企業硫柳汞加入量為該有效抑菌濃度的10倍。硫柳汞對眼部組織的傷害不容小視，已有文獻表明[5]，含0.01%～0.1%硫柳汞的GBR(谷胱甘肽碳酸氫鈉林格氏液)灌注角膜，角膜厚度快速和立即增加，1h內內皮細胞壞死，長期使用可能引起內皮功能和結構損害。因此，A企業抑菌劑加入量過高，處方欠缺合理性。

(2)生產工藝的影響：各企業均采用稱量、配制、過濾、灌裝、檢驗、包裝、入庫等工藝流程，主要區別在于藥液配制環節的溫度控制。A企業配制溫度為80℃，輔料溶解后直接投入原料，攪拌溶解，自然冷卻(約24h)，再經灌裝，檢驗合格后入庫。B、C、D企業的溶解溫度較低，為35～60℃。

采用中國藥典2015年版二部的有關物質檢查方法，結果表明，鹽酸林可霉素在常溫條件下非常穩定，水溶液96h內不會產生新的雜質。在80℃下24h，也無明顯雜質產生。而硫柳汞穩定性差，在常溫下即發生降解，經96h降解為84.7%，降解雜質2為0.02%，降解雜質1為0.5%。在80℃下，硫柳汞快速降解，經24h，降低至72.6%。可見，A企業配制溫度選擇不合理，過高的溫度會加劇硫柳汞降解，產生降解雜質，存在安全風險。

表1 各企業使用抑菌劑的作用機制、抗菌活性及配伍禁忌Tab.1 Mechanism of action of bacteriostat, antibacterial activity and incompatibility

(3)硫柳汞含量及抑菌效力測定：針對現行標準中檢測指標的缺失，采用中國藥典2015年版二部的抑菌劑檢查方法，對A、B企業共46批次樣品的硫柳汞含量進行了測定：A企業25批次樣品，7批次合格，合格率28%，硫柳汞含量為54.4%～84.1%，結果離散性較大，可見處方和工藝參數的不合理對藥品質量產生了嚴重影響；B企業21批次樣品，16批次合格，合格率76.2%，硫柳汞含量為76.3%～84.5%。結果表明，兩家企業的硫柳汞在樣品中均已經發生降解，數據統計見圖2。

參照中國藥典通則1121抑菌效力檢查法，選取不合格產品進行抑菌效力定，結果表明，雖然硫柳汞已經部分降解，但由于加入量過高，其抑菌效力仍可達到藥典要求。

圖2 硫柳汞含量測定數據統計Fig.2 Boxplots of the thiomersal content

(4)硫柳汞降解雜質的LC-MS/MS測定：采用A企業提供的輔料，將氯化鈉與硫柳汞按照處方量進行混合，考察硫柳汞降解雜質產生的原因及變化情況。結果表明，常溫條件下氯化鈉與硫柳汞的反應較為強烈，硫柳汞快速降解，混合后含量降解至94.9%，并產生降解雜質2，含量為0.5%；在產生降解雜質2后，反應繼續進行，24h降解雜質2含量逐步減少，產生降解雜質1和其他雜質；96h，硫柳汞降解為47.3%，降解雜質2含量降低為0.3%，降解雜質1增加為2.6%，并產生其他雜質，詳見圖3。

采用LC-MS/MS法測定并驗證雜質的結構，結果發現，降解雜質2的一級質譜(m/z 304.8[M-H]-，153[M-C7H5O2S]+)與2,2'-二硫代二苯甲酸對照品質譜圖一致，推斷該雜質為2,2'-二硫代二苯甲酸，詳見圖4。

參考相關文獻方法[6]，在硫代水楊酸溶液中加入雙氧水進行氧化，氧化產物為2-亞磺基苯甲酸，將此溶液作為對照品溶液進樣，與樣品中降解雜質1保留時間相同。降解雜質1的一級質譜(m/z 184.9[M-H]-，120[M-SO2H]+)與該溶液質譜圖一致，推斷降解雜質1為2-亞磺基苯甲酸，見圖5～6。

根據上述結果，推測反應過程為：硫柳汞在氯化鈉存在的條件下，分解為硫代水楊酸和氯化乙基汞。硫代水楊酸不能穩定存在，經氧化生成較為穩定的2,2'-二硫代二苯甲酸。2,2'-二硫代二苯甲酸在乙基汞的作用下，一部分分解轉化為硫柳汞，另一部分經兩步氧化轉化為2-亞磺基苯甲酸，見圖7。

圖3 硫柳汞及降解雜質變化情況Fig.3 Statistics on changes in thimerosal and impurities

圖4 降解雜質2一級質譜圖Fig.4 The MS1 of impurity 2

圖5 硫代水楊酸經氧化后質譜圖Fig.5 The MS1 of oxidation of thiosalicylic acid solution

圖6 樣品中降解雜質1質譜圖Fig.6 The MS1 of impurity 1

(5)處方中硫柳汞的合理性：A、B企業處方中使用硫柳汞作為抑菌劑不合理，硫柳汞與氯化鈉存在配伍禁忌，造成硫柳汞降解產生2,2'-二硫代二苯甲酸和2-亞磺基苯甲酸。A企業在處方中添加0.02%硫柳汞，為B企業處方量10倍，加入量過高，存在安全隱患，并且在配制工藝溫度80℃條件下，加速硫柳汞降解，造成降解雜質超出現行標準有關物質限度。眼用藥物中抑菌劑對患者眼部的傷害作用已經引起臨床廣泛關注，汞類抑菌劑對人體組織的傷害不容小視。抗菌類滴眼液中使用汞類抑菌劑存在明顯的安全性風險，應盡快從處方中去除。

圖7 推測硫柳汞降解反應示意圖Fig.7 Proposed route of decomposition of thimerosal

3.2.2 雜質譜研究

(1)雜質譜建立：林可霉素在發酵過程中可能伴生的有關物質以及在過量酸性條件下的降解產物成分復雜，生產廠家不同，菌種不盡相同，導致雜質種類及含量也有所不同。

采用中國藥典2015年版二部的有關物質檢查方法，57批滴眼液樣品及4家企業提供的鹽酸林可霉素原料共檢出7個主要雜質，見圖8，其中林可霉素B為已知雜質，經分析不同企業樣品有關物質的雜質譜，結果顯示滴眼液雜質譜與原料雜質譜基本一致，各主要雜質均為原料引入，雜質含量無明顯差異。

通過LC-MS/MS及與雜質對照品定位共確定4個雜質，分別為：N-去甲基林可霉素(N-desmethyl lincomycin)、α-酰胺基差向異構體(α-amide epimer)、丙烯基類似物和Z-異構體(propylidene analogues)。

(2)主要雜質溯源：通過強制降解實驗，分析主要影響因素及雜質來源，見表2，降解試驗條件如下：①堿破壞：取本品，加入5mol/L的氫氧化鈉溶液2mL，在100℃水浴中加熱30min后取出放冷至室溫，加5mol/L的鹽酸溶液2mL中和；②酸破壞：取本品，加入5mol/L的鹽酸溶液2mL，在100℃水浴中加熱10min后取出放冷至室溫，加入5mol/L的氫氧化鈉溶液2mL中和；③氧化破壞：取本品，加入10%過氧化氫溶液5mL，放置10min；④光照破壞：取本品，在4000Lx光強度下放置48h；⑤高溫破壞：取本品，在60℃水浴中加熱30min后取出放冷至室溫。

圖8 鹽酸林可霉素有關物質雜質譜圖Fig.8 The chromatogram of lincomycin hydrochloride in related substances

(3)雜質控制建議：鹽酸林可霉素的主要雜質為雜質A和B。57批樣品均檢出上述兩種雜質，經二元相關分析，發現雜質A和雜質B均與雜質總量呈正相關(P＜0.01)。提示雜質A和B是本品的主要雜質，在生產過程或儲存環境降解均可使其增加。

現行標準中已對雜質A進行控制。建議增加特定雜質B(丙烯基類似物和Z-異構體，相對保留時間1.2和1.3)的控制，使標準更加完善。由于本次抽驗樣品中雜質C(N-去甲基林可霉素)的量均小于0.05%，暫無控制的必要。

3.2.3 抑菌劑測定方法的完善

現行標準主要存在以下問題：①抑菌劑含量采用外標法計算，對照品溶液的濃度和供試品溶液的濃度差異較大，使計算結果產生較大誤差。②抑菌劑種類的控制存在欠缺，本次抽驗的57批次樣品中46批次采用硫柳汞作為抑菌劑，所占比例較大，建議增加硫柳汞的檢測。

表2 主要雜質溯源Tab.2 The impurity sources and results

(1)對照品溶液濃度的修訂：在實際檢驗中發現，苯甲酸鈉供試品溶液濃度(0.32mg/mL)和對照品溶液濃度(8mg/mL)相差較大。若按照藥典規定的對照溶液濃度進樣，會造成色譜柱過載，出現平頭峰，嚴重影響計算的準確性。為減小誤差，建議對現行標準進行修改，同時增加硫柳汞的檢測，修訂為“精密稱取苯甲酸鈉、苯扎溴銨、羥苯乙酯或硫柳汞對照品適量，加流動相溶解并稀釋制成約含苯甲酸鈉0.3mg/mL、苯扎溴銨0.lmg/mL、羥苯乙酯0.08mg/mL、硫柳汞0.01mg/mL的溶液，作為對照品溶液”。

(2)柱溫的影響：現行標準抑菌劑檢測方法(同含量、有關物質檢測方法)未明確規定柱溫，檢驗中發現硫柳汞峰保留時間受柱溫影響較大，柱溫不合適會導致硫柳汞峰與雜質峰或林可霉素峰重合，影響有關物質和含量的計算結果。采用不同品牌的色譜柱，對柱溫進行考察，結果見表3。建議根據不同的色譜柱選擇合適的柱溫(40～50℃)，確保硫柳汞峰與林可霉素峰及其他雜質的分離，避免對檢測結果造成誤差。

4 結論

本次藥品評價性抽驗結果顯示，依照現行藥典標準檢驗，全部57批樣品均符合規定。但是部分企業處方中存在配伍禁忌，抑菌劑使用不合理，存在安全隱患。因此，國產鹽酸林可霉素滴眼液總體質量狀況“一般”。

建議中國藥典標準進一步完善：(1)提高有關物質的控制水平，完善檢測方法，明確色譜條件的柱溫，并增加制定降解雜質B的控制限度。(2)修訂抑菌劑檢查中對照品溶液的配制濃度，減小誤差，確保結果準確性。

表3 不同品牌色譜柱最佳柱溫試驗結果Tab.3 Results of optimum column temperature for different chromatographic columns

另外，建議A、B企業對處方及生產工藝進行完善：(1)選用其他類型抑菌劑代替硫柳汞，避免配伍禁忌產生雜質對人體造成危害。(2)嚴格控制抑菌劑的使用量，遵循最低有效原則，避免過量添加。(3)降低配液溫度，避免工藝參數不合理造成雜質超標，將安全風險降至最低。