國產四環(huán)素片質量分析

張瓊 張肖寧 肖宇 姜晶 婁志紅

(黑龍江省食品藥品檢驗檢測所，哈爾濱 150080)

四環(huán)素是從放線菌金色鏈霉菌的培養(yǎng)液中分離出來的抗菌物質，屬廣譜抗生素，于1953年輝瑞公司開發(fā)，我國于60年代初試制成功并投產。因其高效、廣譜、經濟等優(yōu)點被廣泛用于革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、細胞內支原體、衣原體和立克次體引起的感染性疾病治療。主要不良反應為胃腸道反應、肝臟毒性和對骨骼、牙組織損傷。

四環(huán)素和四環(huán)素的鹽酸鹽(即鹽酸四環(huán)素)均在市場廣泛應用，四環(huán)素和四環(huán)素片現行標準均收載于《衛(wèi)生部藥品標準＜抗生素藥品第一分冊＞》，美國藥典(USP)40、英國藥典(BP)2017及歐洲藥典(EP)9.0僅收載四環(huán)素原料，制劑均未收載。鹽酸四環(huán)素及鹽酸四環(huán)素片在中國藥典(ChP)、USP40、BP2017均有收載。

四環(huán)素片為2017年國家藥品抽檢品種，共收集24個廠家、25個批準文號、3種規(guī)格(0.05、0.125及0.25g)的200批樣品，其中生產企業(yè)抽取17批，經營單位181批，使用單位2批。

圍繞產品的安全性、有效性和可控性展開探索性研究，并提出合理化建議。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀(賽默飛U3000、Aglient1290及沃特世e2695)；電子天平(賽多利斯BP211D)；酸度計(瑞士Mettler Seven Multi S40K)；多功能微生物自動測量分析儀(北京先驅威鋒技術開發(fā)公司ZY-300IV)；鋼管自動放置器(北京先驅威鋒技術開發(fā)公司ZY-300G)；隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海森信實驗儀器有限公司GRP-9270型)；脈動真空滅菌器(山東新華醫(yī)療器械股份有限公司XG1-BMSD-0.36)；電熱恒溫鼓風干燥箱(上海一恒科技有限公司DHG-9245A)；真空干燥箱(上海森信實驗儀器有限公司DZG-6020型)；生物安全柜(北京東聯哈爾濱儀器制造有限公司BSC-1360ⅡA2)。

4-差向四環(huán)素對照品(批號：130401-200209)、土霉素對照品(批號：130487-200703)、差向脫水四環(huán)素對照品(批號：130403-201205)、四環(huán)素標準品(批號：130306-201419)、鹽酸四環(huán)素對照品(批號：130488-201604)、鹽酸金霉素對照品(批號：130489-201403)和脫水四環(huán)素對照品(批號：130402-200203)均購自中國食品藥品檢定研究院。

四環(huán)素原輔料均為企業(yè)提供。甲醇、乙腈均為色譜級，硅藻土G、鹽酸、硫酸、三氯化鐵、乙二胺四醋酸二鈉、剛果紅、乙醇、氫氧化鈉、冰醋酸、硫酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉等試劑均為分析純；抗生素檢定用Ⅱ號培養(yǎng)基(pH6.5～6.6)購自北京陸橋生物有限公司。

效價用菌種：藤黃微球菌[CMCC(B)28001]由CMCC提供。

2 試驗方法

2.1 法定標準檢驗

按《衛(wèi)生部藥品標準＜抗生素藥品第一分冊＞》進行法定標準檢驗。

2.2 探索性研究

2.2.1 含量測定探索性研究

參考ChP2015中鹽酸四環(huán)素含量測定的液相方法，建立本品含量測定的方法，經方法學驗證，專屬性、回收率、重復性等各項指標良好。

(1)色譜條件與系統適用性試驗

流動相的配制：乙酸銨溶液-乙腈(83:17，V/V)，乙酸銨溶液的配制：以0.15mol/L乙酸銨溶液-三乙胺-0.01mol/L乙二胺四醋酸二鈉溶液(100:1:10，V/V/V)，并用乙酸調節(jié)上述溶液pH值至8.5。采用280mn作為檢測波長，并以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱。系統適用性溶液的配制：精密稱取鹽酸四環(huán)素對照品、土霉素對照品、鹽酸金霉素對照品、4-差向四環(huán)素對照品、脫水四環(huán)素對照品及差向脫水四環(huán)素對照品各適量，置量瓶中，加入適量0.01mol/L鹽酸溶解后，并使用上述鹽酸溶液稀釋至刻度，制成含約0.5mg/mL四環(huán)素溶液以及約含0.03mg/mL其他各雜質對照品的混合溶液，搖勻，即得。精密量取該混合溶液10μL注入液相色譜儀，記錄的系統適用性色譜圖中四環(huán)素峰約在14分鐘出峰，其他雜質對照品：4-差向四環(huán)素、土霉素、差向脫水四環(huán)素按序在四環(huán)素前出峰，金霉素對、脫水四環(huán)素在四環(huán)素后按序出峰。除金霉素峰與脫水四環(huán)素峰間的分離度應大于1.0外，4-差向四環(huán)素峰、土霉素峰、差向脫水四環(huán)素峰、四環(huán)素峰、金霉素峰間的分離度均應大于1.5。

(2)測定法

供試品溶液的制備：精密稱定本品10片，研細，混合均勻，精密稱取適量(約相當于四環(huán)素0.25g)，置250mL量瓶中，加入適量0.01mol/L鹽酸溶解后，并使用上述鹽酸溶液稀釋至刻度，精密量取續(xù)濾液5mL，置50mL量瓶中，用上述鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，即得；對照品溶液的制備：精密稱取鹽酸四環(huán)素對照品適量，加上述鹽酸溶液溶解并定量稀釋制成0.1mg/mL的四環(huán)素溶液，搖勻，即得。分別精密量取供試品溶液與對照品溶液10μL注人液相色譜儀，記錄色譜圖。

2.2.2 有關物質探索性研究

供試品溶液制備(臨用新制或采用低溫進樣器10℃進樣)：取本品10片，研細，混合均勻，精密量取細粉適量(相當于平均片重)，置適宜容量瓶內，加入適量0.01mol/L鹽酸溶解后，并使用上述鹽酸溶液稀釋至刻度，得1.0mg/mL的四環(huán)素溶液，取續(xù)濾液，搖勻，即得。對照溶液的制備：精密量取供試品溶液1mL，置100mL量瓶中，用上述鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。靈敏度溶液制備：精密量取對照溶液2mL，置50mL量瓶中，用上述鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。照含量測定項下的色譜條件，精密量取靈敏度溶液10μL注入液相色譜儀，記錄的色譜圖中其主成分色譜峰(四環(huán)素)峰高的信噪比應大于10。分別精密量取10μL的供試品溶液與對照溶液，注入液相色譜儀，并記錄2.5倍主成分峰保留時間的色譜圖。

2.2.3 水分測定探索性研究

參考USP40、BP2017中(鹽酸)四環(huán)素片干燥失重的測定方法，60℃減壓干燥3h，測定200批次樣品的減失重量。

2.2.4 藥物穩(wěn)定性探索性研究

參照中國藥典2015年版四部指導原則9001“原料藥物與制劑穩(wěn)定性試驗指導原則”，除去內包裝，分別于高溫(60℃)、高濕(85%)條件下放置10d，于0、5和10d取樣，按照有關物質探索性研究項下的色譜條件，考察溫度和濕度對藥物穩(wěn)定性的影響。

3 結果

3.1 法定標準檢驗結果及發(fā)現的問題

24家生產企業(yè)抽取樣品的分布情況(表1)，法定檢驗結果顯示合格率為100%，提示產品質量總體尚可。其中部分企業(yè)崩解時限項和重量差異項檢驗結果存在顯著差異。

3.1.1 企業(yè)內崩解時間(非包衣片)對比分析

200批樣品中共95批次為非包衣片，其中A企業(yè)抽取30批次，有26批次可在3min內崩解，2批次崩解時間超過5min，2批次崩解時間超過10min，對其進行方差分析，結果表明企業(yè)間崩解時限存在顯著差異(P=0.376)，提示該生產企業(yè)關注產品批間穩(wěn)定性。

3.1.2 企業(yè)內崩解時間(糖衣片)對比分析

表1 樣品分布情況表Tab.1 Sample distribution table

105批糖衣片中，I企業(yè)樣品平均崩解時間為16min，SD最大為9.1，同一批號(161202)不同抽樣地點的崩解時間均值分別為40和15min，分析原因為抽樣地點濕度(相對濕度分別為69%和53%)影響崩解時間，提示企業(yè)關注包裝材料的密封性或在包裝內部適當添加干燥劑。由于四環(huán)素片貯存條件為干燥，提示經營單位應嚴格控制貯存條件，避免因貯存不當引起藥品安全性和有效性風險。

3.1.3 重量差異企業(yè)內對比分析

對抽樣量超過20批次的A企業(yè)進行企業(yè)內重量差異方差分析，結果表明其重量存在顯著性差異(P=0.016)，平均片重最大為0.3799g，最小為0.3221g，相對平均偏差為8.2%，表明該企業(yè)批間生產工藝不穩(wěn)定。

3.1.4 法定檢驗發(fā)現的問題

(1)薄層鑒別顯示200批樣品中均有相關雜質斑點檢出。現行標準中僅原料藥采用薄層色譜法控制了4-差向四環(huán)素一個特定雜質，缺少其他特定雜質的限度要求，而四環(huán)素片標準未設置有關物質檢查項，不能有效控制產品在生產、貯存和運輸過程產生的雜質。項目設置存在缺陷。

(2)采用微生物檢定法進行四環(huán)素片含量測定，可直觀反映全部生物活性物質的整體抑菌活性，但不能有效區(qū)別產品中其他相關雜質對含量測定的影響，檢驗方法有一定局限性，可考慮采用HPLC法對含量測定進行有效控制。

(3)15%的樣品包裝規(guī)格為1000片/瓶，對于人用藥物來說，存在包裝合理性問題。

(4)崩解時限和重量差異檢驗結果顯示個別廠家批間生產工藝穩(wěn)定性較差，有待進一步提高。

3.2 探索性研究結果

針對法定檢驗中發(fā)現的問題，圍繞影響產品的安全性、有效性及可控性3方面展開探索性研究。

3.2.1 含量測定

HPLC含量測定限度未做修訂，含鹽酸四環(huán)素(C22H24N2O8·HCl)應為標示量的90.0%～110.0%。按擬定限度判斷，本次抽取的200批樣品中有1批次含量為87.1%，不符合規(guī)定。不合格率為0.5%，合格率99.5%。

24家企業(yè)HPLC含量測定95%置信區(qū)間圖(圖1)顯示，在90.0%～105.0%范圍內，主要集中在95.0%～102.0%區(qū)間內，不同廠家間樣品含量測定結果差異較大，200批含量測定結果有1批低于擬定限度90.0%。從HPLC含量與微生物效價法含量均值對比圖(圖2)可知，微生物效價法測定結果絕大部分較HPLC法測定結果偏高，差值最大可達12.9%。說明藥品中除四環(huán)素主成分有生物活性外，其他相關雜質也具有一定生物活性，以生物活性的加和反映在效價測定，則其結果較以測定四環(huán)素主成分含量的HPLC法結果偏高。

圖1 HPLC含量測定95%置信區(qū)間圖Fig.1 The determination 95% con fi dence interval chart of the content of tetracycline tables (HPLC)

圖2 HPLC含量與微生物效價法含量均值對比圖Fig.2 The measurement results comparison of the average content of tetracycline tables between HPLC method and determination method

雖然四環(huán)素是單一組分物質，但是在其發(fā)酵過程中同時含有土霉素、金霉素、4-差向四環(huán)素、脫水四環(huán)素、差向脫水四環(huán)素等多種活性成分，而且在四環(huán)素片生產、貯存及運輸等環(huán)節(jié)，進一步產生相關雜質，這些物質之間存在拮抗、協同等多種機制的相互作用，影響藥品的穩(wěn)定性，所以采用HPLC法，將上述物質進行分離，從而提供專屬性更強的檢驗方法，在四環(huán)素質控中用于定量分析同時，也可用HPLC法替代原標準中專屬性差的TLC法鑒別。

因此采用HPLC法替代微生物效價法可以更好控制藥物質量，保障產品安全、有效。

3.2.2 有關物質

參照鹽酸四環(huán)素及其片劑標準擬定限度為供試品溶液。色譜圖中如有雜質峰，如：土霉素、4-差向四環(huán)素、鹽酸金霉素、脫水四環(huán)素、差向脫水四環(huán)素按校正后的峰面積(分別乘以校正因子1.0、1.42、1.39、0.48和0.62)，其結果分別不得大于對照溶液主峰面積的0.5倍、8.0倍、0.5倍、1.0倍、1.0倍，其他單個雜質峰面積不得大于對照溶液主峰面積，其他各雜質峰面積的和不得大于對照溶液主峰面積的3.0倍，供試品色譜圖見圖3。

3.2.3 有關物質結果

200批樣品有關物質結果表明：4-差向四環(huán)素含量在3.02%～18.23%，不合格率為43.0%；土霉素含量在0.16%～1.11%范圍內，不合格率為18.0%；脫水四環(huán)素含量為0.08%～3.92%，不合格率為10.0%；其他單個最大雜質含量在0.07%～1.85%，不合格率為5.5%；其他雜質總和含量在0.13%～4.52%，不合格率為3.0%；差向脫水四環(huán)素和金霉素分別為0.02%～0.47%和0.03%～0.17%，不合格率為0，總體不合格批次為98批，總不合格率為49%。

HPLC法測定四環(huán)素含量不合格批次有關物質結果顯示，其特定雜質中4-差向四環(huán)素、差向脫水四環(huán)素、土霉素分別為10.77%、0.70%、0.26%，其他單個最大雜質含量為1.85%，其他雜質總和含量為4.00%。雜質含量偏高是影響其含量測定結果偏低的主要因素。

(1)企業(yè)間4-差向四環(huán)素雜質分析：該項不合格樣品86批次，涉及22家生產企業(yè)(其中18家原料來源為N企業(yè))，Q和C企業(yè)不合格率較高，分別為75.0%和63.6%，含量分別在8.22%～12.93%和8.23%～10.16%范圍內，提示企業(yè)應嚴格控制原料質量，關注生產工藝、運輸及貯存中影響產品穩(wěn)定性的關鍵環(huán)節(jié)；A企業(yè)有3批樣品(批號：160607、160511和170207)超出擬定限度2倍，分別為16.44%、17.06%和18.23%，提示該企業(yè)生產工藝不穩(wěn)定。

圖3 有關物質供試品溶液(A企業(yè)，批號：161206)色譜圖Fig.3 The chromatogram of related substances of the sample solution (A company，batch number: 161206)

(2)企業(yè)間脫水四環(huán)素雜質分析：該項不合格樣品共20批次，來自6家企業(yè)，其中A企業(yè)的15批次樣品超過擬定限度2倍。據文獻報道，pH＜2和高溫條件下，四環(huán)素均易發(fā)生脫水反應，產生脫水四環(huán)素，提示該企業(yè)應關注生產工藝、運輸及貯存中溫度和pH值等關鍵環(huán)節(jié)。

(3)企業(yè)間土霉素、金霉素、差向脫水四環(huán)素等雜質分析：土霉素不合格樣品共36批次，涉及9家企業(yè)，其中A企業(yè)的17批次樣品超過擬定限度，且1批超出限度2倍。因土霉素來源于原料藥發(fā)酵環(huán)節(jié)，提示上述企業(yè)從嚴制定原料藥的內控標準，提高產品質量。

金霉素不合格率為0，差向脫水四環(huán)素不合格率為0，但發(fā)現J企業(yè)不同抽樣地點的同一批號(161202)樣品差向脫水四環(huán)素含量分別為0.41%和0.03%，從抽樣信息分析，前者抽樣地點濕度較大(相對濕度69%)，后者抽樣地點濕度較低(相對濕度53%)，結合法定檢驗中二者崩解時間差異較大，再次提示生產企業(yè)應關注包裝材料的密封性或在包裝內部適當添加干燥劑，經營單位和使用機構應嚴格控制運輸與貯存的濕度，避免產品安全性和有效性風險。

(4)其他單個雜質分析：其他最大單個雜質不合格樣品主要來源于A企業(yè)，含量在1.07%～1.17%；其他雜質總和不合格樣品1批次，為I企業(yè)生產。提示上述企業(yè)關注原料質量和提高生產工藝穩(wěn)定性。

總體來看，影響產品有關物質項不合格的主要因素依次為4-差向四環(huán)素、土霉素、脫水四環(huán)素、其他單個最大雜質，雜質主要來源為四環(huán)素原料，但在制劑的生產、運輸及貯存過程中，水分關鍵因素對產品穩(wěn)定性產生重要影響，建議企業(yè)選擇優(yōu)質原料藥，密切關注各環(huán)節(jié)的水分/濕度參數，確保產品質量安全、有效。

3.2.4 水分相關性探索性研究

結果顯示大部分企業(yè)干燥失重均值在10.23%～13.69%之間，企業(yè)內部差異較小；但個別企業(yè)差異較大：(1)A和F兩個廠家企業(yè)內部差異顯著，尤其是A企業(yè)干燥失重范圍在2.62%～17.09%，5批樣品超出+SD(標準差)，6批樣品超出-SD，其中2批樣品超出-2SD，提示企業(yè)應嚴格控制生產工藝中與水分相關的關鍵環(huán)節(jié)。(2)F企業(yè)的8批樣品干燥失重結果差異顯著，3批非包衣片均值為16.20%，5批糖衣均值為8.75%。從生產批號來看，糖衣片均為2016年5—10月生產，非包衣片為2017年5月生產，提示廠家密切關注生產工藝穩(wěn)定性，嚴格控制非包衣片水分含量。

3.2.5 相關性結果與分析

將差異顯著的A企業(yè)和B企業(yè)的干燥失重結果與有關物質、HPLC含量測定結果進行相關性分析(圖5～6)，結果顯示水分與4-差向四環(huán)素、其他單個最大雜質及其他雜質總和呈正相關；脫水四環(huán)素、差向脫水四環(huán)素及HPLC含量測定與水分呈顯著負相關。

圖5 A企業(yè)相關性分析Fig.5 The correlation analysis of A company

圖6 B企業(yè)相關性分析Fig.6 The correlation analysis of B company

3.2.6 藥物穩(wěn)定性研究結果

試驗表明，高溫、高濕條件下，均可促進四環(huán)素產生4-差向四環(huán)素；同時高溫促進四環(huán)素生成脫水四環(huán)素，4-差向四環(huán)素形成差向脫水四環(huán)素。然而，在高溫或高濕的穩(wěn)定性試驗中，部分企業(yè)出現了4-差向四環(huán)素、差向脫水四環(huán)素和脫水四環(huán)素先增加而后減少的現象，推測為四環(huán)素及其特定雜質在一定條件下發(fā)生了相互轉化。

差向脫水四環(huán)素和脫水四環(huán)素是引起范康尼(fanconi)綜合征(患者出現嚴重惡心、嘔吐、糖尿、蛋白尿及由酸中毒引起的腎水腫等)的主要因素。因此，四環(huán)素及其雜質的轉化相互轉化關系和影響因素對產品安全性和有效性至關重要。

4 討論

影響四環(huán)素質量的主要因素：(1)現行質量標準不完善：與現行鹽酸四環(huán)素標準比較，缺少有關物質項，含量測定和薄層鑒別方法專屬性差，無法滿足目前對藥品質量控制要求，存在“老品種”標準滯后問題，其質量標準亟待提高。(2)處方工藝：個別廠家崩解時間、重量差異、有關物質及水分結果存在顯著性差異，表明批間生產工藝穩(wěn)定性較差；部分企業(yè)同一批號不同抽樣地點的樣品，崩解時間、有關物質及水分含量差異較大，分析生產企業(yè)內包裝密封性不好及經營、使用單位存儲不當。(3)原料：四環(huán)素原料的含量和有關物質直接影響其制劑的質量。制劑企業(yè)應加強對原料質量的控制，按鹽酸四環(huán)素標準從嚴制定原料內控標準，嚴控產品質量，從安全、有效及可控性方面提高產品質量。

影響本品質量的次要因素：(1)部分企業(yè)生產質量風險管理意識不足，過分依賴法定標準檢驗，對“質量源于生產，更源于設計”的理念意識薄弱，建議自主開展針對四環(huán)素片的研究，加強生產工藝中各個環(huán)節(jié)質控要求，促進生產工藝日趨成熟、穩(wěn)定，減少因崩解時限、重量差異不均一穩(wěn)定帶來的臨床使用風險。(2)包裝規(guī)格合理性：1000片/瓶的包裝規(guī)格對于人用藥物來說，存在包裝合理性問題。

根據檢驗結果并結《中國藥典2015年版二部中鹽酸四環(huán)素原料和制劑標準，從嚴控制產品質量，參照USP40、BP2017、中國藥典鹽酸四環(huán)素片及中國藥典2015年版二部鹽酸四環(huán)素原料有關物質限度(表2)，結合探索性研究檢驗結果，擬定有關物質限度見本文3.2.2項。

表2 有關物質限度比較Tab.2 The measurement results comparision of the limit of related substances

4-差向四環(huán)素、脫水四環(huán)素及差向脫水四環(huán)素與中國藥典鹽酸四環(huán)素片一致；由于土霉素與金霉素來源于原料發(fā)酵環(huán)節(jié)，因此限度與鹽酸四環(huán)素保持一致；據文獻報道，四環(huán)素堿較鹽酸四環(huán)素穩(wěn)定性差，因此結合檢驗結果，適當放寬其他單個最大雜質和其他雜質總和限度。