國產注射用硫酸頭孢匹羅質量評價

李偉 曹曉云 郭福慶 楊倩 劉海玲

(天津市藥品檢驗研究院，天津 300070)

硫酸頭孢匹羅是Hoechst(德國)和Roussel(法國)公司研制的第四代頭孢菌素，1992年在瑞典上市，1999年德國安萬特公司獲進口許可，同年石藥集團中諾藥業獲批準文號，國內首仿[1]。其抗菌作用強，抗菌譜廣，對革蘭陽性菌(如葡萄球菌屬、糞腸球菌)、革蘭陰性菌(如布蘭球菌屬、假單胞菌)及厭氧菌敏感，對β-內酰胺酶穩定，可治療敏感細菌引起的呼吸系統感染、泌尿系統感染、腹腔感染、盆腔感染和敗血癥等[2-3]。本品為注射用無菌粉針劑，有0.25、0.5、1.0和2.0g共4個規格。原料企業42家，批準文號43個；制劑企業58家，批準文號112個。注射用硫酸頭孢匹羅在中國藥典2015年版、歐洲藥典EP9.0、美國藥典USP40、英國藥典BP2017及JP17均未收載；進口藥品注冊標準為JX19980078。國內生產企業均執行國家局頒布的注冊標準。JP17收載硫酸頭孢匹羅原料。

為加強對國家基本藥物質量的監督管理，客觀的評價藥品的質量現狀，分析產品的主要質量問題，進而明確提高產品質量的方向[4]。本文在完成法定標準檢驗的基礎上，結合探索性研究對檢驗結果進一步分析，進而對國產注射用硫酸頭孢匹羅的質量現狀進行評價。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 series高效液相色譜儀；島津20A高效液相色譜儀；Shimadzu離子阱飛行時間質譜儀LCMS-ITTOF，LCMS solution V3.80工作站；Shinadzu DTG-60熱重分析儀；Novasina LabMaster水分活度儀；Bruker D2phaser X-射線粉末衍射儀；Malvern APA2000粒度儀；Bruker Matrix-F型近紅外光譜儀；Dionex ICS-5000離子色譜儀；Varian AA240-FS 原子吸收分光光度計。

1.2 試藥

硫酸頭孢匹羅對照品(82.8%)由中國食品藥品檢定研究院提供；來自國內4家生產企業的12批注射用硫酸頭孢匹羅均為2017年國家評價性抽驗樣品；磷酸、磷酸二氫氨、三乙胺為分析純，甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水。

2 實驗方法

2.1 法定檢驗

法定檢驗注射用硫酸頭孢匹羅的質量標準均未在各國藥典收載，我國也尚無統一的國家標準，執行標準為各生產企業獲批的國家食品藥品監督管理局注冊標準。本次檢驗涉及的4個執行標準(YBH38002005、YBH35282005、YBH07712006和YBH03142012)均設置有性狀、HPLC法鑒別、酸堿度、溶液的澄清度與顏色、有關物質、干燥失重、細菌內毒素、無菌、不溶性微粒、裝量差異、可見異物和含量測定項目，部分標準設有化學鑒別、結晶性、頭孢匹羅聚合物檢查等項目。

2.2 探索性研究

根據法定檢驗結果以及檢驗中發現的問題，結合制劑處方工藝及專項調研中對該品種的了解，圍繞原料及制劑的生產工藝、質量標準等方面，本次探索性研究重點關注該品種的安全性、工藝合理性、質量標準的可控性等方面的內容。

2.2.1 有關物質Ⅰ研究[5-7]

色譜條件：色譜柱：Agilent XDB C18(250mm×4.6mm, 5μm)；以0.03mol/L磷酸二氫銨溶液[用磷酸調節pH值至(3.3±0.1)]-乙腈(90:10)為流動相A，以0.03mol/L磷酸二氫銨溶液[用磷酸調節pH值至(3.3±0.1)]-乙腈(60:40)為流動相B，按表1梯度洗脫程序進行線性梯度洗脫；流速：1.0mL/min；柱溫：35℃；檢測波長：270nm；進樣量：20μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

2.2.2 有關物質Ⅱ研究[8-10]

色譜條件：色譜柱：球狀親水硅膠(分子量適用范圍為500～15000)為填充劑[TSK-GELG2000SWXL，(7.8mm±300mm, 5μm)；或效能相當的色譜柱]；流動相：磷酸鹽緩沖液[0.005mol/L磷酸氫二鈉-0.005mol/L磷酸二氫鈉溶液(50:50，V/V)]-乙腈(90:10)；流速：1.0mL/min；檢測波長：254nm；進樣量：20μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

2.2.3 碳酸鈉含量測定[10]

實驗條件：波長：330.3nm；狹縫：0.2nm；燈電流：5.0mA。取對照品溶液及空白溶液在330.3nm的波長處測定吸光度，以濃度為橫坐標，以相應的吸光度平均值為縱坐標繪制標準曲線，取供試品溶液同法測定，由標準曲線計算得供試品溶液中鈉離子的相應濃度，并計算供試品中碳酸鈉的含量。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Linear gradient elution program

2.2.4 制劑中的水分研究[11]

采用熱重法和水活度測定法，考察樣品中游離水和結晶水。利用熱重分析儀及水活度儀對本品制劑和原料中水分的分布情況進一步研究。

熱重法：取樣品適量置于熱重分析儀內微熱天平上的器皿內，起始溫度為30℃，以10℃/min的速度加溫至300℃。

水分活度測定法：取樣品適量置于儀器中的樣品皿中，設定溫度為25℃，平衡時間為25min。

2.2.5 引濕性對樣品穩定性影響的研究[12]

根據中國藥典2015年版四部通則9103藥物引濕性試驗指導原則[13]，對每個制劑生產企業的各一批樣品以及企業B提供的原料進行引濕性試驗，并測定引濕前后各樣品的水活度，然后對引濕前后樣品的有關物質進行測定，判斷水分對藥品穩定性的影響。

2.2.6 晶型與粒度分布研究[11]

3 結果與分析

3.1 法定檢驗結果與分析

按現行質量標準檢驗，4家企業的12批次樣品均符合規定，合格率100%。對現行質量標準與產品質量密切相關的質控項目如酸堿度、溶液的澄清度與顏色、有關物質、頭孢匹羅聚合物和含量測定等結果進行統計分析。

3.1.1 酸堿度

對12批樣品酸堿度測定值進行統計分析，平均值為6.14，分布范圍為5.60～6.77，不同生產企業樣品酸堿度的平均值略有差異，A企業的樣品pH均值最低，為5.93；而C企業的樣品pH均值最高，為6.68。A企業來自不同抽樣地點的批號相同的3批產品，其pH值分別為6.61、5.76和5.60。來自企業倉庫的樣品pH值明顯高于其他抽樣地點的兩批樣品。本產品是由硫酸頭孢匹羅與一定量的無水碳酸鈉混合制成的，碳酸鈉的含量直接影響制劑的pH值大小。結合該3批樣品的碳酸鈉含量存在較大差異，且有關物質未見明顯不同的結果，初步分析可能與硫酸頭孢匹羅與碳酸鈉混合工藝的工藝控制有關，造成批內差異較大。

3.1.2 溶液的澄清度與顏色

法定標準要求0.1g/mL的供試品水溶液應澄清無色；如顯渾濁，與1號濁度標準液比較，均不得更濃；如顯色，與黃色(Y)或黃綠色(YG)9號標準比色液比較，均不得更深(表2)；經檢驗，結果均符合規定(表2)。檢驗過程中發現，企業B和C的樣品顏色均約相當于黃色4號，雖然符合規定，但是顏色偏黃綠色。為保證標準的統一和嚴謹，結合各企業的檢驗結果，建議標準規定修訂為“不得過黃色或黃綠色7號標準比色液”。

表2 溶液的澄清度與顏色標準規定與檢驗結果Tab.2 Standard and test results of clarity and color of solution

3.1.3 有關物質

圖1 最大雜質和總雜質相關性趨勢圖Fig.1 Trend diagram of correlation between the maximum impurity and total impurities

各企業均采用HPLC等度洗脫方式、自身對照法對單個雜質和總雜質量進行控制，企業A采用對照品外標法控制特定雜質2、3-環戊烯并吡啶的含量，經統計分析發現，企業A的總雜質含量相對其他3家企業較低。為了研究最大雜質與總雜質的相關性，對企業A的6批產品中的最大單個雜質使用自身對照法計算，通過對12批樣品的最大雜質含量與總雜質含量進行相關性統計分析可知，最大雜質含量和總雜含質量呈顯著正相關(圖1)。由于企業A在質量標準中控制了2,3-環戊烯并吡啶的含量，其色譜圖中的最大雜質就是2,3-環戊烯并吡啶，其最大雜質和總雜質的量都比其他3家生產企業低。通過了解硫酸頭孢匹羅的合成工藝可知，兩種合成路線中，2,3-環戊烯并吡啶都是必須要使用的原料之一。在探索性研究中還發現，樣品在高溫高濕的情況下極易分解釋放出2,3-環戊烯并吡啶，提示在質量標準中控制其含量，是十分必要的。其他3家企業的法定標準采用不同的色譜系統分析有關物質，其最大雜質是否為2,3-環戊烯并吡啶，將在后續的探索性試驗中進行重點研究。

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3.2 探索性研究結果與分析

針對國產注射用硫酸頭孢匹羅的生產和質量現狀，對有關物質Ⅰ、Ⅱ、制劑中的水分、引濕性對穩定性的影響、碳酸鈉含量、晶形與粒度分布等進行研究，進一步評價各生產企業的產品質量。

3.2.1 有關物質Ⅰ分析

按照“2.2.1”項下建立的梯度洗脫方法能洗脫出強保留的雜質，與法定標準采用的等度洗脫方法比較，檢出的雜質總量多，而且能同時控制特定雜質2,3-環戊烯并吡啶的含量(圖2)。經檢驗，4個生產企業的12批樣品的雜質個數和雜質總量均有明顯增加。通過LC-MS對各企業產品的分析，發現最大雜質均為2,3-環戊烯并吡啶。進一步提示質量標準中控制2,3-環戊烯并吡啶的含量是非常必要的(表3和圖3)。

3.2.2 有關物質Ⅱ分析

頭孢匹羅為β-內酰胺類抗生素，速發型過敏反映在臨床上最為常見，而高分子雜質是引起此類過敏反映的過敏原，控制此類高分子雜質的含量是提高β-內酰胺類抗生素藥品質量的重要手段。目前現行質量標準大部分沒有收載聚合物檢測項，只有少數企業的質量標準中采用葡聚糖凝膠G10柱測定聚合物，但分析時間長，靈敏度低，且頭孢匹羅對照品在流動相B中不締合，一般采用與頭孢匹羅分子量相近的頭孢噻肟或頭孢他啶作為替代，但是與頭孢匹羅的響應值不一樣，未考慮響應因子，從而影響結果的準確性。該研究采用球狀蛋白色譜用親水硅膠(TSK)系統測定的雜質，通過LC-MS分析，主峰前的色譜峰并不都是高分子雜質(聚合物)，且每一個色譜峰也不是純峰，而是多個化合物(雜質)的混合物。而在該系統中檢出的雜質，在RP-HPLC系統中只能部分檢出，RP-HPLC系統不能反映該品種的全部雜質。而TSK系統(圖4)既能檢查本品的高分子雜質，又可作為RP-HPLC檢查有關物質的一個補充，可全面控制本品的雜質，提高本品的質量。

圖2 有關物質色譜圖Fig.2 Chromatograms of related substances

表3 兩種方法測定有關物質的結果Tab.3 Results of the related substances by two methods

圖3 兩種方法測定有關物質總雜質的比較趨勢圖Fig.3 Trend diagram of total impurities in related substances by two methods

3.2.3 碳酸鈉含量測定結果

根據各企業的制劑處方，注射用硫酸頭孢匹羅中碳酸鈉的理論含量為15.5%，而碳酸鈉具有引濕性，可引起硫酸頭孢匹羅降解，影響制劑的穩定性；另外碳酸鈉的粒度較大，易造成與硫酸頭孢匹羅混合不均勻，影響藥品的均一性。因此碳酸鈉的含量與本品的酸堿度、引濕性及穩定性有密切的關系，但現行標準中均未進行控制。按照“2.2.3”項建立的方法對各批次樣品進行測定，4家企業碳酸鈉含量的平均值分別為15.68%、15.17%、16.20%和15.53%，RSD分別為2.1%、2.2%、3.6%和2.6%。進一步證明各企業制劑中碳酸鈉含量批內與批間差異較大，與硫酸頭孢匹羅與碳酸鈉混合工藝的工藝控制有關。通過對碳酸鈉含量和pH值之間的關系進行分析(表4)，可知碳酸鈉的含量直接影響本品的pH值，二者存在正相關性。

圖4 有關物質Ⅱ色譜圖Fig.4 Chromatograms of related substances Ⅱ

表4 碳酸鈉含量與酸堿度的關系Tab.4 Relationship between content of sodium carbonate and pH value

3.2.4 制劑中水分的分析

結合熱重分析法，對樣品及其原料進行分析，從各企業的樣品和原料的熱重圖譜中可見，沒有明顯的吸放熱過程，說明硫酸頭孢匹羅原料中沒有結晶水存在。而從各企業制劑的熱重圖譜中可見，在30～120℃范圍內樣品中的水緩慢失去，60℃時失重比率分布范圍為0.180%～0.493%，120℃時失重比率分布范圍為2.050%～2.300%，也充分說明120℃時樣品中所含的水分能充分揮發出來(圖5)。結合水活度測定結果，各企業樣品中游離水含量很少，說明各企業對水分控制效果比較理想，

分別對所有樣品采用60℃減壓3h和120℃干燥至恒重的方法測定其干燥失重值，120℃干燥至恒重所得干燥失重值略高于60℃減壓3h所得干燥失重值，檢驗數據顯示，120℃干燥方法能更充分地把樣品中的水分揮發出來，最大限度的體現樣品中含有水分的真實情況。

3.2.5 引濕性對樣品穩定性影響的分析

原料藥的引濕性低于制劑，從而使得原料的有關物質在引濕前后幾乎沒有明顯增加。由于制劑中含有一定量的碳酸鈉，導致制劑的引濕性明顯高于原料，引濕后制劑中的特定雜質2,3-環戊烯并吡啶和總雜質都明顯增加甚至超出限度(圖6)，說明注射用硫酸頭孢匹羅在潮濕的環境下不穩定，易解離出2,3-環戊烯并吡啶和其他雜質。

3.2.6 晶型與粒度分布結果分析

X-射線粉末衍射結果顯示，同一廠家不同批次的X-射線粉末衍射特征峰基本一致。企業A的特征峰與其他3家企業有明顯區別(圖7)，說明注射用硫酸頭孢匹羅存在不同的結晶狀態，可能有亞晶型存在或者混晶型情況。結合法定檢驗結果，企業A制劑的2,3-環戊烯并吡啶、總雜質和聚合物含量明顯低于其他3家企業，表明該廠家的晶型具有一定優勢。

不同企業由于所用原料和生產工藝不同，造成產品粒度分布不一致。企業A的不同批次樣品的粒度分布差別較大；來自不同抽樣地點的批號為170156的3批樣品粒度分布也不一致(圖8)，結合此3批樣品的pH值和碳酸鈉含量存在顯著差異的情況，提示該企業制劑生產過程中應加強對原料和生產工藝的控制。

4 結論

通過對法定標準檢驗及探索性研究試驗結果的比較分析，本品合格率為100%。基于現行標準均為局頒標準，項目設置較全面，基本可以實現對本品的質量控制。但存在質控項目缺失、方法設置不合理、限度不統一等問題，建議進一步完善質量標準，修訂有關物質Ⅰ和有關物質Ⅱ檢查項并增加碳酸鈉檢查項。

圖5 熱重分析圖譜Fig.5 Pictures of thermogravimetric analysis

圖6 引濕前后的有關物質色譜圖Fig.6 Chromatograms of related substances before and after hygroscopy

圖7 X-射線粉末衍射圖譜Fig.7 Pictures of X-ray powder diffraction

圖8 企業A制劑的粒度分布圖Fig.8 Particle size distribution map of preparation from manufacturer A

由于碳酸鈉的含量與本品的酸堿度、引濕性及穩定性有密切的關系，且碳酸鈉和硫酸頭孢匹羅粒徑分布范圍不同，容易混合不均勻，影響產品的質量。提示生產企業進一步改進生產工藝，以保證產品的穩定、安全和可靠。