硫酸卡那霉素注射液及滴眼液的質量評價

蔣孟虹 裘亞 張楊慧,2 趙敬丹 張含智 秦峰,3 劉浩,*

(1 上海市食品藥品檢驗所，上海 201203；2 中國醫藥工業研究總院，上海 201203；3 復旦大學化學系，上海 200433)

卡那霉素(kanamycin)是α-去氧鏈胺衍生物組的氨基糖苷類廣譜抗生素，由日本明治制果藥業株式會社于1958年首次上市[1-2]，我國于1966年開始投入生產。本品適用于敏感腸桿菌科細菌如大腸埃希菌、克雷伯菌屬、變形桿菌屬、產氣腸桿菌、志賀菌屬等引起的感染，如肺炎、敗血癥、腹腔感染等，其主要不良反應表現為耳毒性和腎毒性[2-4]。

卡那霉素制劑的原料根據硫酸鹽數目不同分為單硫酸卡那霉素(C18H36N4O11·H2SO4)和硫酸卡那霉素(C18H36N4O11·nH2SO4)兩種。目前，單硫酸卡那霉素收載于中國藥典2000年版(ChP2000)，硫酸卡那霉素收載于ChP2015，其余各國藥典均收錄至少一種原料[5-10]；ChP2015和美國藥典收載硫酸卡那霉素注射液；硫酸卡那霉素滴眼液僅收載于ChP2015。現行標準對原料與制劑的檢驗方法不統一，缺乏對有關物質全面系統的評價，難以真實反映產品的質量。

為加強對國家藥物質量的監督管理，客觀地評價藥品的質量現狀，分析產品的主要質量問題，進而明確提高產品質量的方向[11-12]。硫酸卡那霉素注射液/滴眼液為2017年國家藥品評價性抽驗品種，共計抽樣112批次(其中注射液102批，滴眼液8批)。注射液生產單位均采用單硫酸卡那霉素為原料，加入抗氧劑、絡合劑等輔料攪拌溶解，調節pH值，過濾后灌封。滴眼液生產單位則采用硫酸卡那霉素為原料，加入抗氧劑、防腐劑等輔料攪拌溶解，調節pH值，過濾后灌裝。本文依據現行藥品質量標準的檢驗結果結合探索性研究，評價國產硫酸卡那霉素注射液/滴眼液的質量現狀，對比原研制劑的質量，并從安全性和有效性的角度出發對企業的生產工藝和現行法定標準提出建議。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100型高效液相色譜儀；Vector PCX型柱后衍生化儀；Agilent 1260-6550型四級桿/飛行時間質譜聯用儀；Dionex ICS5000型離子色譜儀，配備EGC淋洗液自動發生器和電導檢測器，ASRS 500(4mm)陰離子抑制器。

1.2 試藥

112批硫酸卡那霉素注射液/滴眼液均為2017年國家評價性抽驗樣品，來自國內的9個生產企業；卡那霉素對照品(批號130556-201502，純度67.9%)、卡那霉素B(批號130548-200501，純度100%)、羥苯甲酯(批號100278-201404，純度100.0%)、羥苯乙酯(批號100847-201604，純度99.9%)、羥苯丙酯(批號100444-201403，純度99.6%)、醋酸氯己定(批號100183-201003，純度96.2%)、苯扎氯銨(批號135051-201401，含n-C12H25為66.04%，含n-C14H29為33.96%)和苯甲酸鈉(批號100433-200301，純度100%)均由中國食品藥品檢定研究院提供；2-脫氧鏈霉胺(批號101838279，純度≥97%)由美國Aldrich公司提供；6-O-(3-氨基-3-脫氧-α-D-葡吡喃糖基)脫氧鏈霉胺(批號D26351，純度95%)由加拿大TRC公司提供；苯甲醇(批號20150906，純度99.0%)由上海凌峰化學試劑有限公司提供；山梨酸(批號：1362218，純度99%)由Fluka提供；三氯叔丁醇(批號20140610，純度98.0%)由國藥集團化學試劑有限公司提供；硫柳汞鈉(批號L990N32，純度98%)由北京百靈威科技有限公司提供；(單)硫酸卡那霉素原料藥和相關輔料均由各制劑生產企業提供；原研注射液樣品(日本明治制果藥業株式會社，批號1103)自購；鄰苯二甲醛、四氫呋喃、甲酸、鄰苯二甲醛、乙腈和甲醇均為色譜純；2-巰基乙醇、硼酸、亞硝酸鈉、硝酸鈉、氫氧化鈉、冰醋酸、硫酸、醋酸鈉、無水硫酸鈉、磷酸鈉、氯化鈉、硫代硫酸鈉均為分析純。

2 實驗方法

2.1 法定檢驗方法

根據各企業樣品的生產日期，按照ChP2010二部或ChP2015二部進行法定標準檢驗。

2.2 探索性研究方法

在法定檢驗結果及注射劑、眼用制劑重點關注項目的基礎上，以完善質量標準為中心，并結合藥品的安全性和有效性等方面，進一步開展雜質譜，防腐劑含量，氯離子、硫酸根離子及硫代硫酸根離子含量等項目的探索性研究。

2.2.1 有關物質[2]

(1)有關物質的測定：色譜柱：Agilent Zorbax Eclipse Plus C18柱(4.6mm×100mm，3.5μm)；流動相：以pH3.4緩沖液(冰醋酸調節)[含0.02mol/L庚烷磺酸鈉溶液和0.11mol/L硫酸鈉溶液]：甲醇(95:5, V/V)為流動相A，pH3.4緩沖液：甲醇(60:40, V/V)為流動相B，按表1進行線性梯度洗脫；柱溫35℃；流速1.0mL/min；進樣體積5μL；樣品濃度0.5mg/mL。取0.8g鄰苯二甲醛、2mL 2-硫基乙醇、300mL甲醇和700mL硼酸鹽緩沖液(pH10.4)[含10.8g/L氫氧化鈉溶液和18g/L硼酸溶液]，混勻，用0.45μm濾膜過濾，作為柱后衍生化試液；衍生化反應溫度35℃；衍生化試液流速為0.8mL/min；熒光檢測器，激發波長為340nm，發射波長為455nm。

表1 流動相梯度洗脫程序Tab.1 The program of gradient elution

(2)雜質鑒定

色譜柱：DionexIonPacTMCG17弱陽離子交換柱(0.4cm×5cm)；柱溫30℃；流速為1.0mL/min；進樣體積5μL；流動相為0.1%甲酸水溶液:0.1%甲酸乙腈溶液(1:1, V/V)；離子源：電噴霧電離源(ESI)，正離子模式掃描；掃描范圍：m/z 50～1700；噴霧電壓：3000V；霧化器溫度：220℃；霧化器流速：19L/min。

2.2.2 滴眼液中防腐劑含量的測定

色譜柱：Waters XBridge C18柱(4.6cm×250mm，5μm)；以0.1%磷酸溶液為流動相A；甲醇為流動相B；四氫呋喃為流動相C；流速1.0mL/min；檢測波長214nm；取原液直接進樣；進樣體積5μL；按表2進行線性梯度洗脫。

2.2.3 滴眼液中氯離子、硫酸根離子及硫代硫酸根離子含量的測定

表2 流動相梯度洗脫程序Tab.2 The program of gradient elution

色譜柱：IonPac AS 11-H C型分離柱(250mm×4mm)；IonPac AG11-HC型保護柱(50mm×4mm)；流動相：KOH梯度淋洗液；流速：1.0mL/min；電導檢測器檢測；進樣體積：25μL；樣品濃度：0.5mg/mL；按表3進行線性梯度洗脫

表3 梯度洗脫程序Tab.3 Linear gradient elution procedure

3 結果與討論

3.1 法定檢驗方法及結果

3.1.1 法定檢驗方法及存在問題

通過對比、調研及實驗發現，現行法定藥品標準存在以下問題：(1)標準不統一：注射液的原料單硫酸卡那霉素僅收載于ChP2000，其中卡那霉素B和含量測定方法分別為薄層色譜法和抗生素微生物檢定法，而ChP2015中硫酸卡那霉素標準相應項目的檢測方法均為液相色譜-蒸發光散射檢測法(ELSD)，方法之間的可比性差，需統一標準。(2)檢驗項目缺失：原料藥和制劑的標準均缺少有關物質檢查項，硫酸卡那霉素滴眼液缺乏防腐劑檢查項，無法全面表征產品質量。(3)限度制定不合理：硫酸卡那霉素注射液中卡那霉素B組分的控制限度為不得過4.0%，其原料藥標準中(ChP2000)規定卡那霉素B的限度為不得過2.0%。由于卡那霉素B組分為發酵副產物，其含量在制劑過程和貯藏等條件下會下降，其限度不應高于原料藥的控制限度。

3.1.2 法定檢驗結果及發現問題

按現行質量標準檢驗，104批硫酸卡那霉素注射液檢驗結果均符合規定，合格率為100%。8批硫酸卡那霉素滴眼液中2批檢驗結果不符合規定，合格率為75%；不合格項目為裝量、滲透壓摩爾濃度、可見異物(表4)。不符合產品集中在個別企業，提示個別企業的GMP管理仍存在缺陷。

表4 不合格樣品的詳細信息Tab.4 Results of the unquali fi ed samples

3.2 探索性研究結果

基于硫酸卡那霉素注射液/滴眼液不合格樣品的原因分析及質量標準現狀，對其雜質譜，滴眼液中防腐劑含量和氯離子、硫酸根離子及硫代硫酸根離子含量等進行研究，以進一步評價各生產企業產品的質量。

3.2.1 雜質譜分析[2]

卡那霉素是由卡那鏈霉菌發酵生產，在發酵和純化工藝中，生物合成主要有效成分卡那霉素A的同時可能生成卡那霉素B、卡那霉素C、卡那霉素D等發酵副產物和降解產物[2,13]。現行質量標準缺少有關物質檢查方法，而ChP2015僅采用HPLC-ELSD法測定卡那霉素B，該方法對雜質的分離能力較差，雜質的控制不全面，且ELSD系統流動相需具有揮發性，使得色譜系統的優化受到限制。

在本部分探索性研究中，我們從中國藥典分離系統出發，對HPLC-ELSD法、HPLC-脈沖安培電化學檢測法和HPLC-柱后衍生化-熒光檢測法進行對比分析，比較不同色譜系統的雜質檢出數量及分離能力，并對其進行優化和改進，最終建立了簡便、快捷的HPLC-柱后衍生化-熒光檢測法，彌補了采用現行中國藥典卡那霉素B測定方法重現性差、靈敏度低、分離能力弱，不能有效控制副產物和降解雜質等問題，供試品溶液的典型色譜圖見圖1。

比較卡那霉素的雜質譜有利于評價不同企業產品的質量。探索性研究采用新建HPLC-柱后衍生化-熒光檢測法，通過半制備色譜對樣品和破壞性試驗中的主要雜質進行分離和富集(系統適用性圖譜見圖2)，應用高效液相色譜-四級桿-飛行時間質譜分析技術進行雜質結構推測和來源歸屬(表5)。

圖1 HPLC-ELSD系統(A)與HPLC-柱后衍生化-熒光檢測系統(B)供試品溶液的典型色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of samples in ELSD (A)and post column derivatization systems (B)

圖2 HPLC-柱后衍生化-熒光檢測法系統適用性典型色譜圖Fig.2 Chromatograms of HPLC-post-column derivatizationfl uorescent detection

采用新建HPLC-柱后衍生化-熒光檢測法，對國內不同來源的原料藥、2個企業8批滴眼液、7個企業104批注射液及1批次原研注射液(日本明治制果藥業株式會社)的有關物質進行測定。對不同來源樣品的分析結果(表6)顯示，原料藥中雜質檢出個數差別不大，但不同企業樣品中卡那霉素B(0.6%～1.6%)和雜質Ⅲ(0.7%～1.9%)的結果差異顯著；降解產物雜質Ⅳ的最低含量為0.5%，而最高含量可達1.8%。這些雜質與發酵條件和純化工藝有關，精制有利于提高產品質量。建議原料生產廠家對生產工藝參數進行優化，加強控制關鍵技術指標，從源頭確保下游產品的質量。

表5 雜質譜研究中雜質的LC-Q-TOF-MS測定數據及解析Tab.5 LC-Q-TOF-MS data and proposed chemical structures of impurities

表6 樣品測定結果Tab.6 Determination results of samples

通過對雜質譜的研究發現，原研注射液中各雜質含量和雜質總量均遠遠低于國產注射液，國產產品的質量顯著低于原研產品；而且國內同一個廠家不同批次及不同廠家之間制劑樣品的的雜質譜均存在較大差異，特別是卡那霉素B和雜質Ⅲ的結果差異顯著(卡那霉素B在0.8%～2.4%之間、雜質Ⅲ在0.8%～2.2%之間)。由于卡那霉素B和雜質Ⅲ均為發酵副產物，并非制劑過程中產生，故提示目前卡那霉素原料藥的生產工藝尚不穩定。建議企業嚴格控制發酵條件，進一步優化分離純化方法，提高產品的批間穩定性和產品質量，降低安全風險。穩定性試驗(溫度40℃，相對濕度75%)結果顯示，溫濕度升高條件下，降解雜質Ⅳ和雜質Ⅴ以及雜質總量增加趨勢明顯，故雜質Ⅳ和雜質Ⅴ可以作為反映制劑內在質量的關鍵指標。

綜上所述，不同廠家雜質情況差異較大的主要原因可能是生產工藝、原料來源、貯藏條件等因素，建議生產企業在我國現有的制劑水平條件下優化生產工藝。

3.2.2 防腐劑含量

為了減小多劑量包裝眼用制劑在使用中被污染的風險，通常需要添加防腐劑，而防腐劑長時間大劑量使用可能造成角膜上皮細胞損傷，甚至產生毒性反應，故需考察評價防腐劑的濃度[14-16]。國產硫酸卡那霉素滴眼液的處方中均含有防腐劑，但現行標準未設置防腐劑檢查項，故本研究建立了HPLC法測定滴眼液中常用防腐劑(季銨鹽類、尼泊金酯類、醇類、有機酸類、有機胍類、有機汞類)的高通量測定方法(系統適用性典型色譜圖見圖3)。對涵蓋2個生產企業抽驗的8批滴眼液進行了防腐劑含量測定。8批硫酸卡那霉素滴眼液檢出的防腐劑種類與產品標簽一致，含量分布在92.5%～104.9%，說明生產企業對防腐劑投料及工藝控制較為理想。

圖3 防腐劑測定系統適用性溶液的典型色譜圖Fig.3 Typical chromatogram of the system suitability solution for preservatives

3.2.3 滴眼液中氯離子、硫酸根離子及硫代硫酸根離子含量

滲透壓摩爾濃度反映溶液中各種溶質對溶液滲透壓貢獻的總和。法定檢驗結果顯示批號為151201的硫酸卡那霉素滴眼液不符合規定項目為裝量和滲透壓摩爾濃度。其中，滲透壓摩爾濃度高出上限值的6.6%。為了考察滲透壓偏高的原因，探索性研究建立了測定硫酸卡那霉素滴眼液中Cl-、SO42-和S2O32-的離子色譜法。I企業批號為151201的樣品中Cl-和SO42-的含量較同來源其他批號樣品略高。結合該批次樣品裝量和滲透壓摩爾濃度的檢驗結果，分析原因可能和儲藏過程中包裝材料的密封性不佳，導致水分揮發。提示生產企業應采用密閉性良好的包裝材料，保證藥品在儲藏及運輸過程產品的安全性。

4 結論

本次評價性抽驗采用法定檢驗結合探索性研究對國產硫酸卡那霉素注射液/滴眼液的法定標準和質量現狀進行了分析和評價。

按照法定檢驗標準，本次抽驗樣品合格率為98.2%。不合格項目為裝量、滲透壓摩爾濃度、可見異物，均來自同一生產企業。其中1批的不合格原因可能與儲藏過程中包裝材料的密封性有關，建議生產企業對包裝材料的密封性進行再評價。

通過探索性研究，對產品中的主要雜質結構和來源進行了歸屬，分析不同廠家雜質情況差異較大的原因，主要是生產原料來源、工藝和貯藏條件等因素造成，建議原料生產企業對生產工藝參數進行優化，加強控制關鍵技術指標，從源頭控制產品的質量；建議制劑生產企業在我國現有的制劑水平條件下優化生產工藝。通過探索性研究還進一步完善了卡那霉素原料藥和制劑的法定質量標準：(1)新建有關物質測定方法，彌補了現行卡那霉素B測定方法重現性差、靈敏度低的缺陷以及分離能力弱，不能有效控制副產物和降解雜質的問題，填補了各國藥典無有關物質測定儀器分析方法的空白；(2)建議硫酸卡那霉素滴眼液的質量標準中增加對有關物質、防腐劑含量的控制；(3)建議新版藥典重新收載單硫酸卡那霉素質量標準，對單硫酸卡那霉素和硫酸卡那霉素現行標準進行統一。