國產妥布霉素滴眼液質量評價

于明艷 耿雪 張乃斌 張冬梅 李玉杰 祝清芬 凌霄

(山東省食品藥品檢驗研究院，濟南 250101)

妥布霉素屬于氨基糖苷類抗生素，能夠在細菌核糖體30S和50S亞基的聯結位置聯結，阻礙70S復合物的形成，使mRNA不能翻譯成蛋白質，導致細菌死亡。主要對革蘭陰性菌，如銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、克雷伯菌、變形菌、檸檬酸桿菌有效。臨床主要用于結膜炎、角膜炎等眼部細菌感染，特別是對慶大霉素耐藥的革蘭陰性菌感染，如嚴重的銅綠假單胞菌感染有效[1-3]。

妥布霉素滴眼液于1981年3月15日由美國愛爾康公司研究上市，商品名“TOBREX”。其主要用于敏感細菌所致的外眼及附屬器的局部感染。不良反應主要表現為偶見局部刺激癥狀，不宜與其他腎毒性或耳毒性藥物合用或先后應用[4-5]。國內生產企業共31家，批準文號37個；國外在華注冊企業1家，進口批準文號1個，規格均為0.30%(3mg/mL)。按裝量標示，有5、8、9、10和0.4mL的包裝規格。目前僅中國藥典二部及美國藥典(USP)41收載妥布霉素滴眼液[1,6]。2018年國家評價性抽驗共抽取到174批次妥布霉素滴眼液，旨在客觀地評價國內藥品的質量現狀，分析產品的主要質量問題，進而明確產品質量提高的方向。本文依據現行藥品質量標準的檢驗結果結合探索性研究，對國內市場上的妥布霉素滴眼液產品質量進行了系統性分析研究，并提出對現行藥品標準改進的建議。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-20AT高效液相色譜儀(DAD檢測器)；Q ExactiveTM超高效液相色譜－質譜聯用系統；Agilent 7890氣相色譜儀-7697頂空進樣器；Mass Frontier 7.0軟件(Thermo Fisher Scieni fi c, MA, USA)；Mettler MS105DU電子天平；二氧化碳培養箱(德國Memmert公司)；高壓蒸汽滅菌器(日本Sanyo公司)；酶標儀(美谷生物)；MJ-250I霉菌培養箱；GHP-9270隔水式恒溫培養箱(上海一恒科技有限公司)。

1.2 試藥

妥布霉素對照品：批號：130527-200402，含量：91.4%，購自中國食品藥品檢定研究院；新酶胺對照品：批號：130411-200908，含量：100%，購自中國食品藥品檢定研究院；卡那霉素B對照品：批號：130548-200501，含量：100%，購自中國食品藥品檢定研究院；尼泊拉胺對照品：批號：10-RAJ-168-2，含量：95%(硫酸鹽形式)，購自Toronto Research Chemicals(TRC)；脫氧鏈酶胺卡那胺對照品(雜質D、妥布霉素A)：批號：9-KPA-46-1，含量：97.95%，購自TRC；苯扎溴銨：批號：135051-201401，10.9mg/mL，購自中國食品藥品檢定研究院；苯扎氯銨：批號：1300549-201504，12.19mg/mL，購自中國食品藥品檢定研究院；羥苯乙酯：批號：100847-201604，含量：99.9%，購自中國食品藥品檢定研究院；羥苯丙酯：批號：100444-201403，含量：99.6%，購自中國食品藥品檢定研究院；硫柳汞鈉：批號：143172，含量：96.6%，購自Dr.Ehrenstorfer GmbH C 17515000；乙腈(Merck)、乙醇(科密歐)、二甲基亞砜(科密歐)、均為色譜純；三羥甲基氨基甲烷購自國藥，批號：20160907，含量≥99.0%；2,4-二硝基氟苯：購自Tokyo Chemical Industry(TCI)，批號：68XD2378，含量＞99.05%；DPBS緩沖液，批號：20180712，購自Hyclone公司；MTT，批號：MKBL3665V，購自Sigma-Aldrich公司；異丙醇，批號：20160928，購自天津市康科德技術有限公司；組織培養液B，批號：20180831，購自廣東博溪生物科技有限公司。Bio OcullarTMRHE三維角膜模型，批號：OT180803，購自廣東博溪生物科技有限公司

銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104] 3-20180709-2、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003] 3-20180712-2、大腸埃希菌[CMCC(B)44102] 3-20180630-1、黑曲霉[CMCC(F)98003] 3-20180713-2；白念珠菌[CMCC(F)98001] 3-20180619-1，以上菌種購于中國食品藥品檢定研究院醫學菌種保藏中心，工作菌種為第三代。

胰酪大豆胨瓊脂培養基(批號：172441)、沙氏葡萄糖瓊脂培養基(批號：172401)均購于廣東環凱微生物科技有限公司；氯化鈉(批號：20171030)購于國藥集團化學試劑有限公司。

妥布霉素滴眼液174批次均為2018年國家計劃抽驗樣品，來源于21家生產企業。

2 試驗方法

2.1 法定檢驗

根據各廠家藥品批準文號信息，按2015年版中國藥典或國家食品藥品監督管理局標準(YBH02042016/YBH08652009/YBH17182006)進行法定檢驗。

2.2 探索性研究

根據法定檢驗結果，結合文獻檢索情況，圍繞著藥品安全性、有效性和質量標準的可控性，進一步開展雜質譜分析、有關物質、抑菌劑眼刺激性、抑菌效力等項目的探索性研究。

2.2.1 雜質譜分析

色譜條件：Agilent Zorbax S B-C18柱(4.6mm×250mm, 5μm)；流動相：10mmol/L三氟乙酸；柱溫：40℃；流速：0.5mL/min；進樣量：10μL。

質譜條件：質譜采用加熱ESI源，正/負離子模式。加熱ESI離子源參數如下：

毛細管電壓：3200V(正負離子模式)噴霧電壓為3.0kV，毛細管溫度和霧化器分別為350和250℃。鞘氣和輔助氣分別設為275.58和103.4kPa, S-lens RF電壓為50V。噴霧氣和碰撞氣均為氮氣。掃描方式采用正離子Full MS/dd-MS2模式，此模式包含1次一級全掃描(分辨率70000FWHM)和1次數據依賴的二級掃描(分辨率17500FWHM)2個事件。一級全掃描范圍為m/z 100～1000，自動增益控制(AGC)和離子注入時間(IT)分別設為1.0e6和100ms；數據依賴的二級掃描(dd-MS2)AGC設為2.0e5，最大IT設為50ms，觀察窗(isolation window)設為1.0m/z，未充滿系數(underfill ratio)設為1.0%，強度閾(intensity threshold)設為4.0e4，同位素排除(exclude isotopes)設為“on”，動態排除(dynamic exclusion)設為10.0s;碰撞模式：高能量碰撞解離(HCD)；碰撞能量：NCE30，遞增率(Stepped)NCE 50%。

2.2.2 有關物質測定

色譜條件：乙腈和三羥甲基氨基甲烷(簡稱Tris)溶液(取Tris2.0g加水溶解稀釋至800mL，加入1mol/L硫酸溶液20mL)作為流動相，進行梯度洗脫，見表1。流速：1.2mL/min；檢測波長：254nm；進樣量20μL分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

衍生化處理方法：量取待衍生溶液適量，置于50mL容量瓶中，加水2mL 2,4-二硝基氟苯溶液10mL、三羥甲氨基甲烷試溶液10mL，搖勻，蓋上塞子，置于60℃水浴中加熱50min，取出，加乙腈至離刻度約2cm處，冷卻至室溫，加乙腈至刻度，搖勻，即得。

表1 流動相梯度洗脫Tab.1 The gradient elution table of HPLC mobile phase

2.2.3 抑菌劑眼刺激性

采用3D角膜上皮模型來評價不同抑菌劑的眼刺激反應。3D角膜上皮模型以人角膜上皮細胞為種子細胞，通過精細調節培養液成分，使細胞在體外分化形成3D角膜組織。具有與人角膜上皮高度相似的結構與功能。該評價模型采用人源的角膜上皮模型與受試物相接觸，通過給藥后MTT細胞活性檢測方法測得模型ET50值，評估不同樣品的體外眼刺激性[7-8]。受試物采用的試驗濃度為表2所示。

2.2.4 抑菌效力考察

將21家企業的產品按照中國藥典2015版通則[1121]抑菌效力檢查法進行抑菌效力的考察。

3 結果及討論

3.1 法定檢驗

174批次妥布霉素滴眼液依據現行質量標準檢驗，173批次符合規定，1批次檢查項羥苯乙酯不符合規定，合格率99.4%。該不合格批次產品生產日期為2017年4月。經分析，其不合格原因為：(1)羥苯乙酯在堿性條件下不穩定，該企業生產工藝中PH調節值高于大部分企業；(2)羥苯乙酯放置易降解，該不合格批次生產時間為2017年4月，屬于貨架末期產品；(3)經調研其他企業多為高限投料，以保證貨架期產品羥苯乙酯檢查符合規定,該不合格批次生產企業羥苯乙酯投料量不能保證在效期內降解后羥苯乙酯檢查合格。

表2 3D角膜上皮模型眼刺激性實驗給藥孵育時間設計Tab.2 Incubation time for eye stimulation experiment using human cornea-like epithelial tissue model

3.2 現行質量標準發現的問題

本次評價的妥布霉素滴眼液不同生產企業添加的抑菌劑種類不同。添加的抑菌劑涉及苯扎氯銨、苯扎溴銨、羥苯乙酯、羥苯丙酯、硫柳汞鈉。其中硫柳汞鈉中含有汞，在人體中會有殘留富集作用，同時對眼表損傷較大，不建議作為抑菌劑在眼用制劑中使用。在標準檢驗中發現一家企業使用硫柳汞鈉作為抑菌劑。

現行質量標準雜質譜控制不全面。妥布霉素為發酵來源的抗生素，在發酵過程中易產生與其結構類似的雜質。現行標準僅控制單個雜質及其他各雜質的和，對特定雜質沒有控制，無法評價不同企業產品間的雜質譜的不同，進而反映不同企業產品的質量差異。

3.3 雜質譜分析

采用Q-Exacive Plus高分辨液質對不同生產企業的產品進行分析。發現各生產企業的產品雜質譜TIC一致，獲得一級離子豐度較高的4個雜質，其[M+H]+分別為324.1765、323.1925、484.2613和307.1976。采用MassFrontier軟件推測4個雜質可能為脫氧鏈霉胺卡那胺、尼泊拉胺、新霉胺和卡那霉素B。本研究通過購買獲得了上述雜質對照品，用Q-Exacive Plus高分辨液質對雜質對照品脫氧鏈霉胺卡那胺、新霉胺、卡那霉素B、尼泊拉胺進行分析。將雜質對照品一級二級質譜與妥布霉素滴眼液樣品中豐度較高的4個雜質的一級二級質譜進行對比，確認4個雜質分別為脫氧鏈霉胺卡那胺、尼泊拉胺、新霉胺和卡那霉素B，雜質結構及信息見表3。

表3 4種雜質的結構信息Tab.3 Structural informations of four impurities

3.4 有關物質研究

參照進口注冊標準JX20100135色譜條件及柱前衍生的方法，采用的衍生化試劑為2,4-二硝基氟苯(DNFB)，在妥布霉素結構中引入有紫外吸收的二硝基苯基基團，使妥布霉素及其雜質具有紫外吸收，進而采用HPLC-UV的方法對其有關物質進行檢查。將進口注冊標準JX20100135流動相條件由等度改成梯度洗脫，將經高分辨液質確認的4個雜質制訂入標準。新建立的有關物質檢查方法能夠將各個雜質與主峰進行有效分離，同時排除輔料和抑菌劑對雜質的干擾，特定雜質的檢出由JX20100135的兩個(新霉胺、卡那霉素B)增加到4個(脫氧鏈霉胺卡那胺、尼泊拉胺、新霉胺、卡那霉素B)(圖1)。采用Gastrolplus公司ADMET predictor 9.0軟件對上述4個雜質進行毒性預測。各雜質對大鼠和小鼠均有致癌性，其中脫氧鏈霉胺卡那胺和新霉胺還具有肝毒性。

3.5 抑菌劑的眼刺激性

采用3D角膜上皮模型評價抑菌劑眼刺激性，與傳統的兔眼刺激法相比，該評價體系數據客觀、靈敏度高，能夠避免動物間的差異以及由動物外推至人的種屬差異性。應用該模型評價妥布霉素滴眼液中抑菌劑的眼刺激性，通過抑菌劑ET50的比較(ET50越小，眼刺激性越大)，以孵育時間為橫坐標，組織活性值作為縱坐標作受試物溶液對組織活性影響作折線圖(圖2)。結果顯示羥苯乙酯、羥苯丙酯各處方濃度用量24h均未測到眼刺激性，硫柳汞鈉、苯扎氯銨、苯扎溴銨各處方濃度用量均表現出眼刺激性。具有刺激性的硫柳汞鈉、苯扎氯銨、苯扎溴銨在同一濃度(0.1mg/mL)下，刺激性程度依次為硫柳汞鈉＞苯扎氯銨(n-C12H25、n-C14H29取代)〉苯扎氯銨(n-C12H25取代)＞苯扎溴銨(圖3)。本次評價還發現n-C12H25、n-C14H29取代的苯扎氯銨刺激性大于n-C12H25取代的苯扎氯銨。在抑菌效力考察中，n-C12H25、n-C14H29取代的苯扎氯銨及n-C12H25取代的苯扎氯銨在同等的處方用量的情況下(0.1mg/mL)，對真菌和細菌的抑菌效力均能達到A級(表4)。建議滴眼劑中的苯扎氯銨使用刺激性較小的n-C12H25單體型苯扎氯銨。

3.6 抑菌效力的考察

圖1 系統適用性圖譜Fig.1 System suitability

圖2 抑菌劑對角膜組織活性的影響Fig.2 Effect of preservatives on corneal tissue activity

圖3 同一濃度(0.1mg/mL)下各抑菌劑刺激強度對比圖Fig.3 Contrast diagram of stimulus intensity of preservatives at the same concentration (0.1mg/mL)

妥布霉素滴眼液為抗生素類滴眼液，盡管抗生素有一定的抗菌作用，但是不同種類抗生素的抗菌譜不同，對抗菌譜以外的微生物起不到抑菌作用，因此多劑量眼用制劑應選擇適當的抑菌劑，保證其在多次使用時不被微生物污染。本次評價對21家企業的妥布霉素滴眼液進行抑菌效力研究，其中3家企業的產品未達到中國藥典2015年版眼用制劑抑菌效力判斷標準。按照各企業抑菌劑使用情況，抑菌效力測定結果見表4。對各個廠家產品抑菌效力進行分析，排除處方中除抑菌劑以外其他輔料的干擾。由于妥布霉素屬氨基糖苷類抗生素，對細菌的抑制作用較強，未添加抑菌劑和使用羥苯乙酯(處方濃度0.1mg/mL)的妥布霉素滴眼液對真菌的抑菌效力較差，未達到中國藥典2015年版眼用制劑抑菌效力的要求。苯扎溴銨抑菌效力較好，處方濃度為0.05、0.1和0.2mg/mL時抑菌效力均能達到A級，根據中國藥典2015四部抑菌效力中抑菌劑使用應是最低有效濃度的原則，部分企業使用的苯扎溴銨的濃度未使用最低有效濃度，存在過量添加的問題。

4 結論

本次評價性抽驗結果顯示，國產妥布霉素滴眼液總體質量一般，產品合格率為99.4%。不合格項目為抑菌劑羥苯乙酯的檢查。

探索性研究揭示，目前國產妥布霉素滴眼液質量標準仍有提高的空間，有關物質、含量測定方法可做進一步修訂。該品種不同企業抑菌劑添加的情況也不同，建議加強對抑菌劑處方篩選的研究。抑菌劑對眼部均有不同程度的刺激性，過量使用抑菌劑，將會給臨床用藥帶來安全隱患。同時眼用制劑中某些抑菌劑由于自身穩定性的原因，抑菌劑的濃度會隨時間而逐漸降低，達不到有效濃度，不能保證藥品使用的安全。因此，抑菌劑的合理使用和質量控制是保證多劑量包裝眼用制劑安全性、有效性的關鍵。

表4 抑菌效力測定結果Tab.4 Test results of bacteriostatic efficacy