氧化石墨烯對嗜熱四膜蟲的毒性效應

廖苑辰,常葉倩,徐晨珂,崔益斌,李 梅*

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氧化石墨烯對嗜熱四膜蟲的毒性效應

廖苑辰1,常葉倩1,徐晨珂1,崔益斌2,李 梅1*

(1.南京大學環境學院,污染控制與資源化研究國家重點實驗室,江蘇 南京 210023；2.生態環境部南京環境科學研究所,江蘇 南京 210042)

以嗜熱四膜蟲()作為受試生物,考察了納米材料氧化石墨烯(GO)對其細胞生長率、乙酰膽堿酯酶(AchE)和氧化應激酶活性、生物膜損傷及細胞凋亡的影響,以探究GO的毒性效應.結果表明,GO濃度高于32mg/L時顯著抑制嗜熱四膜蟲的細胞增殖(<0.05),細胞存活率低于50%;在0~64mg/L實驗范圍內,隨GO暴露濃度增加,細胞內活性氧自由基(ROS)和超氧化物歧化酶(SOD)水平呈先升后降的趨勢,AchE活性受抑;GO抑制位于線粒體內膜的琥珀酸脫氫酶(SDH)活性,促進細胞質中乳酸脫氫酶(LDH)的釋放;64mg/L GO導致四膜蟲細胞出現明顯凋亡現象.以上結果顯示,中低濃度GO(0~8mg/L)暴露下,氧化應激機制對細胞毒性起主要貢獻作用;高濃度GO(32和64mg/L)作用下,四膜蟲凋亡現象的產生可能是GO抑制其生長作用導致的.

氧化石墨烯(GO)；嗜熱四膜蟲；毒性效應；氧化應激

納米材料氧化石墨烯(GO)因其獨特的物理及化學性質,在生物、醫學和材料科學等領域具有廣闊的應用前景,尤其作為藥物的靶向載體,被廣泛用于生物醫藥領域.然而,GO在生產、貯存、運輸、消費或廢棄過程中不可避免地進入到環境中,造成暴露風險,最終可能通過直接排放或地表徑流等方式遷移進入水體,對水生生態系統產生危害.研究表明,GO可進入溶酶體、線粒體、細胞核和內質網,誘導氧化應激和細胞凋亡[1],并通過改變細胞活力和形態、破壞膜完整性、誘導DNA損傷[2-4]等方式，對紅細胞、成纖維細胞和大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞(PC12)等產生毒性.目前,有關GO對水生生物的毒性效應研究主要圍繞藻類[5-7]、魚類[8-10]、雙殼類動物[11]和部分浮游動物[12-13]展開,而對原生動物的研究較少[3].

原生動物是無細胞壁的單細胞真核生物,直接暴露在水環境中,對污染物更為敏感,在水環境污染物毒性研究中發揮重要作用.四膜蟲()外觀呈橢圓形長梨狀,體長約50μm.作為一種模式生物,四膜蟲在過去幾十年已成為一種有效的檢測工具,被廣泛應用于外源化學物質的潛在毒性研究[14].

本研究以嗜熱四膜蟲作為研究對象,結合細胞數和乙酰膽堿酯酶活性、氧化應激酶活性、生物膜損傷和凋亡形態學等指標,考察GO對四膜蟲的細胞毒性、氧化應激、生物膜系統損傷和細胞凋亡的影響,為評估GO對四膜蟲的毒性效應及其作用機制提供基礎數據和科學依據.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

嗜熱四膜蟲株系()由中國科學院水生生物研究所贈予.采用SPP培養基:2%胰蛋白胨,0.1%酵母膏提取物,0.2%葡萄糖,0.003%西奎斯特林(13% Fe-EDTA)培養,加入100μL 100′青鏈霉素合劑,121℃滅菌20min,冷卻后4℃保存.

GO購自南京先豐納米材料科技有限公司.

1.2 試驗方法

1.2.1 GO懸液配制及表征 GO懸液現配現用.將GO固體薄片置于滅菌超純水中,使懸液中GO濃度為1mg/mL,超聲處理15min(功率200W,10s脈沖,5s間隔),使體系充分分散.用超純水稀釋如下濃度:5, 20,80,320,640mg/L作為懸液母液,對照組為滅菌超純水.

GO形貌特征表征采用透射電鏡(TEM, Tecnai 12,荷蘭Philips公司)、拉曼光譜(HR-800,法國Horiba Jobin Yvon公司)和傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR, Nicolet iS5,美國Thermo Fisher Scientific公司)進行.

1.2.2 GO對嗜熱四膜蟲細胞生長率的影響 根據預試驗結果,確定正式試驗GO濃度分別為:0.5, 8,32,64mg/L.取處于對數培養期的四膜蟲培養液9mL裝至50mL螺紋離心管中,加入1mL相應濃度GO懸液母液進行培養,使GO終濃度為0.5,8,32, 64mg/L.每組設置3個平行,另設空白對照,置于光強3000lx左右,30℃的恒溫培養箱中培養,分別于24h 和48h進行細胞密度計數.根據實驗結果作時間-劑量-效應圖,并利用T檢驗確定是否具有顯著性.

1.2.3 酶活性指標的測定 培養方法同前,72h后離心(1000r/min,3min,4℃),取上清液測定乳酸脫氫酶(LDH)活性.再取細胞沉淀,加入磷酸鹽緩沖液(PBS)后超聲破碎細胞(JY88-II型超聲細胞破碎儀,超聲20s,間隔10s,重復6次).將破碎后的細胞懸液離心(12000r/min,5min,4℃),取上清液測定活性氧自由基(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)、乙酰膽堿酯酶(AchE)和琥珀酸脫氫酶(SDH)活性.試驗用試劑盒及方法均來自南京建成生物工程研究所.

1.2.4 四膜蟲細胞凋亡檢測 培養方法同前,72h后離心(1000r/min,3min,4℃),棄上清液.用細滴管將余下的0.5mL細胞懸液逐滴加入4℃預冷的1.5mL無水乙醇(99%)中,邊加邊震蕩,4℃冰箱過夜,固定18h.細胞固定后2周內進行實驗.通過加入PBS調整懸液濃度為1′106個細胞/mL,取1mL上述細胞液,離心后(1000r/min,3min,4℃)用PBS洗滌,重復3次,去除殘留乙醇,棄上清,留細胞沉淀.加入RNA酶A(100μg/mL),37℃水浴中孵育30min.孵育結束再加入0.5mg/mL碘化丙啶(PI)染液50μL進行DNA染色,4℃再孵育60min.上機前用200目尼龍濾網過濾,流式細胞儀于488nm激發條件下對細胞凋亡情況進行分析.每個樣品檢測微粒數為2′104個.

1.3 數據分析

利用SPSS 20.0軟件處理實驗所得數據,進行正態分布檢驗,并用T檢驗和方差分析(ANOVA)進行統計處理.以<0.05表示具有顯著性差異.

2 結果與討論

2.1 GO表征

通過TEM、拉曼光譜和FTIR對GO進行相關表征,結果如圖1所示.本實驗所用GO主要以單片層形式存在,其片層厚度相對均一,約1~2nm,在納米尺度范圍內.拉曼譜圖驗證了GO在1330cm-1(D帶)和1576cm-1(G帶)附近有兩個特征峰.紅外譜圖顯示GO具有大量親水性官能團,如3363cm-1附近出現明顯吸收峰,代表O—H伸縮振動;1732cm-1處特征峰代表GO石墨片層邊緣C=O伸縮振動[15];1371cm-1附近的峰歸屬O—H的彎曲振動;1074cm-1處為C—O的伸縮振動.該納米材料在水中的分散情況良好.

2.2 GO對四膜蟲的毒性效應

2.2.1 GO對四膜蟲細胞生長率的影響 分別于培養24和48h后計數,得到四膜蟲在不同時間及不同濃度GO下的存活數量(圖2).結果顯示在培養細胞中加入一定量GO后,相同暴露時間內,隨GO濃度的增加,四膜蟲細胞數量減少.高濃度GO(32和64mg/L)明顯抑制細胞的增殖(<0.05).經驗證,GO對四膜蟲活性影響在48h內與時間關系不顯著.Zhao等[16]研究了GO對小球藻()的毒性效應,結果顯示,GO可通過遮蔽效應抑制約16%藻類的生長.石柳等[12]研究發現,GO對大型溞()的毒性表現出一定劑量-效應關系,在65~ 143mg/L范圍內,隨GO濃度的升高,大型溞死亡率從10%逐漸增加到100%.另有研究表明,GO對小眼蟲()的96h EC50為(3.76±0.74)mg/L,當GO濃度超過2.5mg/L時產生明顯不良反應(<0.01),抑制生物生長[3].上述研究結果與本實驗結果存在一定差異,因為不同生物之間GO毒性大小有所區別,且培養基營養成分的不同也可能對GO的毒性造成影響[3].

圖2 GO對嗜熱四膜蟲細胞生長率的影響Fig.2 Effects of GO on cell growth rate of T.thermophila與CK組相比有顯著差異,*P<0.05

用單個樣本K-S檢驗、Q-Q圖分別對24和48h四膜蟲細胞數的正態分布進行檢驗(圖3).在SPSS中執行“分析-非參數檢驗-單個樣本K-S檢驗”,24h的值為0.745,值0.636>0.05;48h的值為0.606,值=0.856>0.05;Q-Q圖中,各點基本圍繞圖中對角線.正態檢驗結果說明本實驗所得GO毒性數據呈近似正態分布.

2.2.2 GO對四膜蟲的氧化應激作用 氧化應激被認為是納米材料重要的毒性機制[16].細胞內的ROS水平能直接反映細胞自由基的產生情況.SOD是機體抗氧化防御體系中的關鍵酶,可通過其在機體內含量和活性的變化間接反映機體的氧化損傷程度,保護細胞免受ROS的不利影響[17].

結果表明GO處理下ROS和SOD水平均隨其濃度增大呈現先升后降的趨勢(圖4).在0~8mg/L范圍內,隨著GO暴露濃度增加,細胞內ROS含量升高,說明中低濃度GO可誘導四膜蟲細胞產生氧化應激,此時細胞中的SOD活性增強以清除ROS,減輕GO造成的氧化脅迫.高濃度GO(32和64mg/L)條件下,ROS和SOD均呈大幅下降,結合GO濃度高于32mg/L暴露下,四膜蟲存活率不足50%的情況,推測此時嗜熱四膜蟲難以生存,細胞中的抗氧化酶被破壞,導致酶活性降低.已有研究證實,GO能誘導藻類細胞和斑馬魚產生氧化應激,引起ROS的產生,破壞細胞完整性[18]. Nogueira等[19]將綠藻暴露于0~ 100μg/L GO,發現當其濃度為20μg/mL時,綠藻的生長抑制率為50%,且在96h孵育時間內,GO濃度與ROS產生呈顯著正相關(<0.05);Lu等[20]將斑馬魚暴露于10mg/L GO培養14d,發現GO誘導斑馬魚胚胎產生過量ROS,造成斑馬魚明顯的組織損傷.上述結果表明GO的毒性作用可能與其誘導細胞內ROS含量增加有關,提示本研究中高濃度(32和64mg/L)GO對細胞的毒害作用可能是由于ROS升高造成的.

2.2.3 GO對四膜蟲AchE活性的影響 GO暴露下四膜蟲AchE活性變化見圖5,當GO濃度大于8mg/L時,隨暴露濃度升高,AchE活性呈下降趨勢.由圖4可知,8mg/L GO作用下ROS活性最高,已有研究證實H2O2作為ROS的一種對AchE具有調節作用,高濃度H2O2抑制AchE活性[21],因此猜測8mg/L GO誘導ROS活性升高,導致AchE活性受抑.一般而言,當AchE活性抑制率大于20%時,說明污染物對生物體有暴露毒性作用的存在;抑制率大于50%時,認為污染物對生物生存產生危害[22].本實驗中GO高濃度(32和64mg/L)處理下,AchE活性抑制率超過50%,表明GO對四膜蟲造成毒害作用,威脅生物生存.另外,考慮到乙酰膽堿作為神經遞質在運動行為控制中起重要作用[23],四膜蟲的運動能力也受到一定程度的抑制.這也驗證了2.2.2中GO濃度高于32mg/L時四膜蟲難以存活的結果.周夢媛等[24]關于Al2O3納米顆粒對梨形四膜蟲細胞毒性的研究亦顯示,高濃度(500mg/L)納米Al2O3抑制四膜蟲AchE活性.

圖5 GO暴露下四膜蟲AchE活性變化Fig.5 Variation of acetylcholinesterase (AchE) activity of T.thermophila after GO exposure與CK組相比有顯著差異,* P<0.05

2.2.4 GO對線粒體內膜、細胞膜的影響 SDH位于線粒體內膜,參與三羧酸循環和電子傳遞鏈,能反映細胞功能狀態的糖代謝過程,其濃度可以表征四膜蟲細胞線粒體活性的高低及內膜完整程度[24].GO的存在使四膜蟲SDH活性受到抑制,暴露濃度越高,抑制作用越明顯(圖6A).與對照組相比,各處理組SDH活力均顯著降低(<0.05).Zhou等[25]對暴露于石墨烯的各種類型細胞SDH活性進行檢測,發現在所有測試細胞中,石墨烯以劑量-依賴方式直接抑制SDH活性,與本實驗結果相符.線粒體是ROS產生的重要場所,也是ROS攻擊的主要部位.相關研究已證實納米材料能誘導氧化應激產生ROS,破壞線粒體膜完整性[26].本實驗中,GO抑制SDH活性,推測GO使四膜蟲細胞線粒體活性降低,內膜受損,細胞能量代謝受阻,從而抑制細胞生長.結合GO對四膜蟲的生長抑制作用(圖3),進一步證實SDH活性變化可能與細胞增殖有關[24].

LDH作為胞質酶穩定存在于細胞質中,當細胞凋亡或裂解造成細胞膜結構破壞時即被釋放到細胞外,因此該酶是細胞膜完整性的重要指標,可作為細胞死亡的信號.不同濃度GO處理后對四膜蟲LDH活性的影響如圖6(B)所示.低濃度(0.5mg/L)條件下,GO對LDH的釋放無影響;當GO濃度高于8mg/L時,處理組LDH活性較對照組顯著升高(<0.05),說明細胞膜損傷嚴重,胞內組分釋放,四膜蟲的生命活動受到影響.Zhang等[27]研究了石墨烯和碳納米管對PC12細胞的毒性作用,發現石墨烯和碳納米管均能誘導細胞內LDH表達水平升高.另有研究證實,GO能誘導HeLa細胞LDH的釋放[28],與本實驗結果一致.

目前,有關納米材料細胞毒性的研究有3種主要機制:氧化應激、金屬毒性和物理刺穿導致細胞破裂[29].針對石墨烯家族納米材料(GFNs)的毒性機制,有研究提出,GFNs通過不同方式進入細胞,誘導ROS產生,使LDH增加,隨后引起各種細胞損傷(如細胞膜損傷、線粒體損傷、細胞凋亡或壞死等),是GFNs細胞毒性的主要可能機制[30].在本實驗中,GO濃度為0~8mg/L時,GO與細胞作用產生的ROS呈濃度依賴性(圖4A),LDH亦呈上升趨勢,推測由于GO誘導細胞產生ROS,ROS水平過高引發脂質過氧化反應,損傷細胞膜,此時可能是ROS對細胞毒性起貢獻作用;高濃度GO(32和64mg/L)暴露下,ROS低于正常水平,而胞外LDH活性顯著升高,推測四膜蟲細胞受到破壞,從而產生強毒害作用.

2.2.5 GO對四膜蟲細胞凋亡形態學分析 以上結果已證實GO能引起細胞膜及線粒體的損傷,為進一步檢驗其毒性,利用流式細胞儀對GO暴露下的四膜蟲細胞凋亡形態學進行分析(圖7).PI是一種DNA染料,由于其不能透過活細胞膜,但當細胞膜破損后可進入細胞,因此常用于鑒定死細胞.前向散射光(FSC)的強度與細胞體積大小和活力有關,側向散射光(SSC)能反映細胞的復雜程度.隨著GO濃度的上升,四膜蟲的細胞趨向于細胞結構復雜程度上升和體積變大,表明細胞發生了凋亡現象. Kang等[31]的研究證實GO以劑量依賴性方式誘導PC12細胞凋亡.Hu等[29]認為GO對細胞膜的物理損傷作用是導致細胞凋亡的主要原因.Wang等[32]研究發現,氧化應激是人胚肺成纖維細胞暴露于GO后細胞凋亡和DNA損傷的關鍵原因.另有研究表明,GO可直接通過影響細胞線粒體活性從而導致細胞凋亡[29].本研究中,64mg/L GO能明顯引起細胞凋亡,但GO對四膜蟲細胞的具體凋亡途徑及其機制有待進一步研究.

圖7 不同濃度GO暴露下的凋亡形態學分析 Fig.7 Flow cytometry analysis under different GO concentrationsP2代表不同取樣的粒子區位,P1表示發生變化的粒子區位

3 結論

3.1 GO濃度高于32mg/L時,嗜熱四膜蟲生長受到顯著抑制(<0.05),細胞存活率低于50%.

3.2 在實驗濃度范圍內,隨GO暴露濃度增加, ROS和SOD水平呈現先升后降的趨勢,AchE活性降低,細胞毒性增強.GO抑制位于線粒體內膜的SDH活性,促進細胞質中LDH的釋放,破壞細胞膜和線粒體內膜完整性.64mg/L GO能引起四膜蟲細胞明顯凋亡.

3.3 中、低濃度(0~8mg/L)GO暴露下,氧化損傷對細胞毒性起主要貢獻作用;高濃度(32和64mg/L)GO暴露下,四膜蟲凋亡現象的產生可能是GO抑制其生長作用導致的,具體凋亡途徑及其機制仍需進一步研究.

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Toxicity effects of graphene oxide to

LIAO Yuan-chen1, CHANG Ye-qian1, XU Chen-ke1, CUI Yi-bin2, LI Mei1*

(1.State Key Laboratory of Pollution Control and Resource Reuse, School of the Environment, Nanjing University, Nanjing 210023, China；2.Nanjing Institute of Environmental Sciences, Ministry of Ecology and Environment, Nanjing 210042, China)., 2019,39(3)：1299~1305

Effects of graphene oxide (GO) on the growth, acetylcholinesterase (AchE) activity, oxidative stress, membrane damage and apoptosis ofwere investigated. The results showed that the concentrations higher than 32mg/L GOsignificantly inhibited the growth of(<0.05), and the cell survival rate was less than 50%. With the increase of GO concentration (0~64mg/L), the levels of reactive oxygen species (ROS) and superoxide dismutase (SOD) incells initially also increased but then decreased while the activity of AchE decreased. GO inhibited the activity of succinate dehydrogenase (SDH) and promoted the release of lactate dehydrogenase (LDH). Highest concentration of GO (64mg/L) caused cell apoptosis. Based on the results, it can be concluded that oxidative stress contributed to cytotoxicity at low and medium concentrations of GO (0~8mg/L) while at higher concentrations (32 and 64mg/L) of GO, apoptosis ofmay be causedby GO inhibiting its growth.

graphene oxide (GO)；；toxic mechanism；oxidative stress

X172

A

1000-6923(2019)03-1299-07

廖苑辰(1996-),女,福建長汀人,南京大學碩士研究生,主要研究方向為環境毒理學.

2018-08-19

國家自然科學基金資助項目(41571468,41773115),江蘇省科技支撐項目(BE2016736)

* 責任作者, 教授, meili@nju.edu.cn