加味腦泰方對大鼠缺氧/復氧損傷海馬神經元炎性通路SIRT1/NF—κB的影響

易亞喬　劉檢　劉林　成紹武　廖君　王國佐　譚琥　劉吉勇　陳俊煒　王瑋　郭艷幸　葛金文

摘要：目的 觀察加味腦泰方對大鼠缺氧/復氧損傷海馬神經元炎性通路SIRT1/NF-κB的影響，初步探討其作用機制。方法 原代分離、培養及鑒定SD大鼠胎鼠海馬神經元，采用缺氧24 h、復氧2 h干預構建缺氧/復氧細胞模型。將培養的原代海馬神經元隨機分為正常組、空白血清對照組、模型組、陽性藥藥物血清組和加味腦泰方藥物血清組，待缺氧24 h后，除正常組和模型組給予等量培養液外，其余各組分別給予相應體積分數10%藥物血清或空白血清，繼續復氧共孵育培養2 h；采用MTT法檢測海馬神經元細胞活力，高內涵細胞成像分析系統檢測海馬神經元沉默信息調節蛋白1（SIRT1）、核因子-κB抑制蛋白（IκBα）、核因子-κB（NF-κB）蛋白表達。結果 與正常組比較，模型組海馬神經元細胞活力顯著降低（P<0.01），神經網絡及樹突、樹突棘斷裂或減少，細胞明顯受損，且神經元內SIRT1、IκBα蛋白表達顯著降低（P<0.05），NF-κB蛋白表達明顯增加（P<0.05）；與模型組比較，陽性藥藥物血清組和加味腦泰方藥物血清組海馬神經元細胞活力明顯增加（P<0.05），神經網絡、樹突棘受損明顯改善，且神經元內SIRT1、IκBα蛋白表達明顯上調（P<0.05），NF-κB蛋白表達明顯下調（P<0.05）。結論 加味腦泰方對缺氧/復氧損傷海馬神經元內炎性相關信號通路SIRT1/ NF-κB具有明顯的調控作用，這可能是其保護缺氧/復氧損傷海馬神經元繼而抗血管性癡呆的重要機制之一。

關鍵詞：加味腦泰方；海馬神經元；缺氧/復氧；沉默信息調節蛋白1；核因子-κB抑制蛋白；核因子-κB；血管性癡呆；大鼠

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2019）03-0045-06

Effects of Modified Naotai Prescription on Inflammatory Pathway of SIRT1/NF-κB in Hypoxia/Reoxygenation Injured Hippocampal Neuron

YI Yaqiao1， LIU Jian2， LIU Lin2， CHENG Shaowu1， LIAO Jun3， WANG Guozuo1， TAN Hu1，

LIU Jiyong1， CHEN Junwei1， WANG Wei1， GUO Yanxing4， GE Jinwen3

1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China；

2. First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China；

3. Integrative Medicine Basic Key Disciplines of Hunan Province， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China； 4. Luoyang Bonesetting Hospital of Henan Province， Luoyang 471002， China

Abstract： Objective To observe the effects of modified Naotai Prescription on inflammatory pathway of SIRT1/NF-κB in hypoxia/reoxygenation injured hippocampal neurons； To explore the mechanism of action. Methods Hippocampal neurons from SD rats were primitively isolated， cultured and identified. Hypoxia/ reoxygenation （H/R） cell model was established by hypoxia 24 h and reoxygenation 2 h intervention. The cultured cells were randomly divided into normal group， blank serum group， model group， positive medicine serum group and modified Naotai Prescription group. Normal group and model group were given same amount culture medium， while other groups were given relevant amount of 10% medicated serum or blank serum to continue for reoxygenation and incubate for 2 h. Hippocampal neuronal cell viability was detected by MTT assay. The expressions of SIRT1， IκBα and NF-κB in hippocampal neurons were detected by HCA. Results Compared with the normal group， hippocampal neuronal cell viability significantly decreased （P<0.01）， the neural network and dendrites and dendritic spines were broken or reduced， the cells were obviously damaged， and the expressions of SIRT1 and IκBα protein in neurons significantly decreased （P<0.05）， and the expression of NF-κB protein significantly increased （P<0.05） in the model group. Compared with the model group， hippocampal neuronal cell viability significantly increased （P<0.05）， the neural network and dendritic spine were significantly improved， and the expressions of SIRT1 and IκBα protein in the neurons increased （P<0.05）， and the expression of NF-κB protein was down-regulated （P<0.05） in positive medicine serum group and modified Naotai Prescription group. Conclusion Modified Naotai Prescription has a significant regulatory effect on the inflammatory-related signaling pathway SIRT1/NF-κB in hippocampal neurons after hypoxia/reoxygenation injury， which may be an important mechanism for protecting hypoxic/reoxygenated hippocampal neurons and then anti-vascular dementia.

Keywords： modified Naotai Prescription； hippocampal neurons； hypoxia/reoxygenation； SIRT1； IκBα； NF-κB； vascular dementia； rats

血管性癡呆（vascular dementia，VD）是由于缺血性、出血性卒中或造成記憶、認知和行為等腦區低灌注的腦血管疾病所致的嚴重認知功能障礙綜合征[1]。VD發病率逐年增加，不但嚴重影響患者生活質量，同時也帶來沉重的醫療負擔，目前臨床尚無治療VD的特效藥物，主要從改善腦微循環、認知功能障礙、神經遞質紊亂及保護腦細胞等方面著手[2-3]。VD發病機制目前尚未完全闡明，研究發現沉默信息調節蛋白1（silent information regulator 1，SIRT1）是細胞內信號轉導網絡的關鍵靶點，在調控血管性認知功能障礙及細胞衰老、凋亡等方面均發揮著重要作用[4]，另外，SIRT1 mRNA在海馬神經元中高度表達，其能通過抗炎效應減輕缺血性腦損傷，而炎癥反應在VD等慢性腦缺血繼發性神經損傷中起主要作用。因此，SIRT1可能是抗VD的潛在靶點。

加味腦泰方源自《醫林改錯》補陽還五湯，并結合臨床治療VD用藥經驗加減而成，由黃芪、當歸、川芎、地龍、石菖蒲、三七、遠志組成。本課題組前期研究發現，加味腦泰方能明顯改善VD大鼠學習記憶能力，并抑制炎癥相關因子核因子-κB（NF-κB）的表達[5-6]。本研究采用原代海馬神經元缺氧/復氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）體外細胞模擬缺血再灌注VD模型，觀察加味腦泰方對H/R損傷海馬神經元保護作用，并從SIRT1炎性通路初步探討其機制。

1 實驗材料

1.1 動物

SD雌性大鼠5只，SPF級，受孕18 d；SD雄性大鼠9只，SPF級，體質量180～220 g，均購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK（湘）2013-0004。飼養于溫度（25±1）℃、相對濕度（55±5）%環境，12 h光照，自由攝食飲水。

1.2 藥物

加味腦泰方（黃芪、川芎、地龍、當歸、石菖蒲、三七、遠志），飲片購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院中藥房，水煎制成浸膏粉（湖南中醫藥大學藥學院制劑教研室提取）；奧拉西坦注射液，廣東世信藥業有限公司，批號1610002。本實驗中加味腦泰方和奧拉西坦給藥劑量分別為12 g/kg和0.36 g/kg。

1.3 主要試劑與儀器

Neurobasal medium、B27 Supplement（Gibco公司），DMEM/F12、FBS（Hyclone公司），兔抗大鼠神經元特異性烯醇化酶（NSE）多克隆抗體（武漢博士德生物工程科技公司），兔抗大鼠SIRT1、IκBα、NF-κB多克隆抗體（Proteintech公司），小鼠抗大鼠β-tublin和β-actin抗體、FITC標記羊抗兔IgG、R-PE標記羊抗小鼠IgG及DAPI（Abcam公司）。SW-CJ-2FD型超凈工作臺（蘇州智凈凈化設備有限公司），S8PAO型體視顯微鏡（德國Leica公司）、CO48R-230型細胞培養箱（New Brunswick Galaxy公司），OPERETTA型高內涵細胞成像分析系統（HCA，美國PerkinElmer公司）。

2 實驗方法

2.1 藥物血清制備

取SD雄性大鼠9只，按體質量隨機分為空白血清對照組、陽性藥藥物血清組、受試藥藥物血清組，分別給予等量蒸餾水、臨床等效劑量奧拉西坦和加味腦泰方浸膏粉灌胃，每日2次，連續3 d，末次給藥1 h，10%水合氯醛麻醉，腹主動脈采血，3000 r/min離心15 min，收集血清，56 ℃水浴滅活30 min，0.22 μm微孔濾膜過濾后，分裝至-80 ℃冰箱保存備用。

2.2 海馬神經元原代培養與鑒定

取孕18 d SD大鼠，10%水合氯醛麻醉后迅速取全腦置于體視顯微鏡下，分離海馬，加入等體積胰蛋白酶和膠原酶，37 ℃消化15 min，終止消化，收集上清液，1000 r/min離心5 min，棄上清液，重懸，200目篩網過篩，調整細胞密度為3×105個/mL，接種至預先左旋多聚賴氨酸包被的細胞培養板中，4～6 h后全量換成無血清培養基（98%Neurobasal、1%B27、1% L-谷氨酰胺），之后每3 d半量換液1次。待神經元生長至5～7 d，棄掉孔內液體，冷0.01 mol/L PBS潤洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，0.25%Triton-100作用15 min，5%BSA封閉30 min，加入兔抗大鼠NSE和小鼠抗大鼠β-tublin一抗稀釋液（體積比1∶100），4 ℃濕盒避光孵育過夜。次日棄液，冷0.01 mol/L PBS潤洗5次，加入FITC標記的山羊抗兔和RP-E標記的山羊抗小鼠二抗稀釋液（體積比1∶200），37 ℃避光孵育30 min，棄液，冷0.01 mol/L PBS潤洗5次，加入DAPI稀釋液，室溫避光孵育20 min，棄液，冷0.01 mol/L PBS潤洗3次，最后每孔加入50 μL PBS，于HCA上觀察并拍照。

2.3 造模、分組及給藥

取生長7 d成熟海馬神經元，隨機分為正常組、空白血清對照組、模型組、陽性藥藥物血清組、加味腦泰方藥物血清組，參照文獻[7]方法，建立H/R細胞模型。將細胞培養液換成無糖DMEM培養基，同時置入三氣細胞培養箱中，持續通入混合氣體（95%N2+5%CO2），流速保持在0.5 L/min，缺氧24 h后，模型組重新換成無血清培養液繼續培養，其余組全量換液相應含10%空白血清、奧拉西坦藥物血清及加味腦泰方藥物血清的無血清培養基，再將各組放回細胞培養箱中持續復氧2 h。正常組則用無血清培養基正常培養26 h，不做任何處理。

2.4 MTT法檢測海馬神經元活力

將海馬神經元接種至96孔板中，待細胞生長至5～7 d，隨機分為正常組、空白血清對照組、模型組、陽性藥藥物血清組和加味腦泰方藥物血清組，除正常組外，其余各組分別進行缺氧24 h、復氧2 h處理，每組設3個復孔，造模后，每孔加入20 μL MTT，37 ℃孵育4 h，棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，于水平搖床上震搖15 min，于酶標儀492 nm波長處測定吸光度（OD），并計算細胞活力。細胞活力（%）=實驗組OD值÷正常組OD值×100%。

2.5 HCA檢測沉默信息調節蛋白1、核因子-κB抑制蛋白、核因子-κB蛋白表達

將海馬神經元接種至96孔板中，待細胞生長至5～7 d，隨機分為正常組、空白血清對照組、模型組、陽性藥藥物血清組和加味腦泰方藥物血清組，上述各組細胞進行缺氧24 h、復氧2 h后，棄掉孔內液體，冷0.01 mol/L PBS潤洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，0.25%Triton-100作用15 min，5%BSA封閉30 min后，加入小鼠抗大鼠β-actin和兔抗大鼠SIRT1、IκBα或NF-κB一抗稀釋液（體積比1∶100），4 ℃避光孵育過夜，棄液，冷0.01 mol/L PBS潤洗5次，加入FITC標記的山羊抗兔和RP-E標記的山羊抗小鼠二抗稀釋液（體積比1∶200），37 ℃避光孵育30 min，棄液，冷0.01 mol/L PBS潤洗5次，加入DAPI稀釋液，室溫避光孵育20 min，棄液，冷0.01 mol/L PBS潤洗3次，最后每孔加入50 μL PBS，于HCA上進行熒光檢測并拍照，隨機選取6個視野，先找到DAPI標記的細胞核，再找到β-actin標記的細胞骨架，計算DAPI與β-actin融合區域（即目標細胞）陽性表達蛋白的熒光強度值，最后通過分析得到每個細胞的平均熒光強度值（即相對熒光強度值）。

3 統計學方法

采用SPSS16.0統計軟件進行分析。實驗數據以—x±s表示，組間差異采用方差分析，方差齊用LSD檢驗，方差不齊用Dunnett's T3檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 海馬神經元形態學特點及免疫熒光鑒定

在倒置光學顯微鏡下觀察，海馬神經元之間可見突觸連接，胞體明顯、突起縱橫交錯，并相互交織成豐富的神經網絡。經免疫細胞化學染色及HCA檢測，NSE標記陽性者呈綠色熒光，在神經元骨架被β-tublin標記后，可見綠色熒光在胞漿中均呈陽性表達，提示所得細胞為目標細胞（即海馬神經元）。結果見圖1。

4.2 加味腦泰方對海馬神經元細胞活力的影響

與正常組比較，模型組海馬神經元細胞活力均明顯降低，提示造模成功；與模型組比較，陽性藥藥物血清組和加味腦泰方藥物血清組細胞活力顯著增加，差異有統計學意義（P<0.05）。結果見圖2。

4.3 加味腦泰方對缺氧/復氧損傷海馬神經元沉默信息調節蛋白1、核因子-κB抑制蛋白、核因子-κB蛋白表達的影響

經HCA檢測，藍色熒光為DAPI標記的細胞核，橙黃色熒光為RP-E標記的細胞骨架β-actin，綠色熒光為FITC標記的炎性相關陽性表達蛋白SIRT1、NF-κB或IκBα，HCA隨機選取6個視野，先找到DAPI標記的細胞核（即總細胞數），再找到β-actin標記的細胞骨架（即表達區域），計算DAPI與β-actin融合區域內FITC標記的陽性表達蛋白（即蛋白相對表達量），進而分析得到每個細胞的平均熒光強度值（即相對熒光強度值）。經H/R干預造模后，HCA檢測結果顯示，與正常組比較，模型組及空白血清對照組海馬神經元SIRT1、IκBα蛋白平均熒光強度值明顯降低，NF-κB蛋白平均熒光強度值明顯增加，差異均有統計學意義（P<0.05），且神經網絡及樹突、樹突棘斷裂或減少，細胞明顯受損；與模型組比較，陽性藥藥物血清組和加味腦泰方藥物血清組海馬神經元SIRT1、IκBα蛋白平均熒光強度值明顯增加，NF-κB蛋白平均熒光強度值明顯降低，差異均有統計學意義（P<0.05），神經網絡、樹突棘受損情況得到明顯恢復，而熒光強度與蛋白表達水平呈正相關，提示加味腦泰方對H/R損傷海馬神經元內炎性相關蛋白SIRT1、NF-κB和IκBα具有明顯的調控作用，其可能是保護H/R損傷海馬神經元的重要機制之一。見圖3～圖8。

5 討論

VD是以認知、記憶等諸多功能缺損為主，并且可能伴有語言、人格或情感障礙的一種獲得性智能持續性損害疾病，而腦血管病變導致局部或全腦缺血、缺氧，繼而引起腦部與認知、記憶等相關的特定神經組織損害是VD發病的主要病理過程，因而慢性腦缺血成為研究VD發病機理的重要組成部分。相關動物實驗研究表明，雙側頸總動脈永久性結扎術（2-VO法）能持續造成慢性腦低灌注狀態，從而使腦組織特別是易損區域（如海馬、皮層等）產生缺血缺氧性損傷，導致漸進性VD發生[8]。本研究采用原代海馬神經元H/R體外細胞模型，結果顯示H/R干預造模后海馬神經元細胞存活率顯著降低，神經網絡及樹突、樹突棘斷裂或減少，細胞明顯受損，很好模擬了體內VD發病腦缺血供氧不足的海馬神經元損傷過程，提示造模成功。

長壽蛋白（silent mating type information regulation 2 homolog，Sirtuin）是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴的一種去乙酰化酶，與酵母沉默調控因子2（silent information regulator 2，Sir2）蛋白同源，由SIRT1～7組成，其中SIRT1與Sir2同源性最高。研究發現，SIRT1介導的信號通路與學習記憶、認知功能的改善密切相關，SIRT1 mRNA在海馬神經元具有豐富的表達，敲除小鼠SIRT1后，突觸可塑性明顯受損，學習記憶、認知能力下降[9]。此外，SIRT1/NF-κB信號通路介導了VD病理機制的炎癥過程，慢性缺血缺氧VD發生時，NF-κB作為腦缺血后反應最早的炎癥因子，SIRT1可促使其下游因子NF-κB亞單位RelA/p65去乙酰化，進而抑制其轉錄活性，同時抑制IκBα磷酸化，減少炎癥因子和趨化因子的產生，防止炎癥引起的神經元損傷[10-11]。本實驗結果表明，與正常組比較，經H/R干預造模后，海馬神經元內SIRT1、IκBα蛋白水平顯著降低，NF-κB蛋白水平顯著增加，且細胞明顯受損，而給予加味腦泰方藥物血清干預后，SIRT1、NF-κB和IκBα蛋白表達異常被明顯逆轉，這提示加味腦泰方可能是通過調控SIRT1/NF-κB信號通路進而保護H/R損傷海馬神經元。

VD好發于中風之后，屬中醫學“呆證”“善忘”等范疇[12]，病機特點為本虛標實，病位在腦，五臟氣血虧虛為本，痰瘀阻絡為標，虛、瘀、痰是其重要的病因病機。加味腦泰方以黃芪為君，當歸為臣，川芎、地龍等為佐藥，具有益氣活血、化痰祛瘀之功效。現代藥理研究發現，當歸小分子多糖、三七皂苷R1等具有顯著抗炎、抗氧化、改善腦缺血和促進VD大鼠的學習記憶功能[13]。本課題組前期研究發現，腦泰方通過抗血小板活化、抗血栓、抗炎等作用對缺血缺氧腦組織起到明顯的保護作用[14-15]。本實驗結果亦再次佐證了其調控炎性通路進而保護H/R損傷海馬神經元的作用，而腦缺血缺氧是VD的重要病因之一，因此，我們推測加味腦泰方可能對VD有防治作用。

綜上，加味腦泰方對H/R損傷海馬神經元炎性通路SIRT1/NF-κB具有明顯的調控作用，這可能是其保護H/R損傷海馬神經元繼而抗VD的重要機制之一，后續實驗我們將從基因水平，并輔以基因沉默技術，進一步闡明加味腦泰方對H/R損傷海馬神經元的保護機制。

參考文獻：

[1] BENISTY S. Current concepts in vascular dementia[J]. Geriatr Psychol Neuropsychiatr Vieil，2013，11（2）：171-180.

[2] IMFELD P， BODMER M， SCHUERCH M， et al. Risk of incident stroke in patients with Alzheimer disease or vascular dementia[J]. Neurology，2013，81（10）：910-919.

[3] MORI E. How treatable is vascular dementia？[J]. Brain Nerve， 2016，68（4）：441-450.

[4] RAMADORI G， LEE C E， BOOKOUT A L， et al. Brain SIRT 1：Anatomical distribution and regulation by energy availability[J]. Jeurosci， 2008，28（40）：9989-9996.

[5] 易亞喬，肖碧躍，劉英飛，等.加味腦泰方對血管性癡呆大鼠學習記憶和海馬區NR2A及NR2B表達的影響[J].中南醫學科學雜志，2014，42（1）：17-20.

[6] 廖君，張薇，夏興，等.腦泰方對局灶性腦缺血大鼠腦組織核因子-κB、基質金屬蛋白酶9及其抑制劑表達的影響[J].中國中醫藥信息雜志， 2013，20（9）：28-30.

[7] 趙嚴冬，劉潘虹，李學敏，等.遠志皂苷元抗H/R誘導皮層神經元凋亡的機制初探[J].中國病理生理雜志，2014，30（7）：1166-1171.

[8] FARKAS E， LUITEN P G， BARI F. Permanent，bilateral common carotid artery occlusion in the rat：a model for chronic cerebral hypoperfusion-related neurodegenerative diseases[J]. Brain Res Rev，2007，54（1）：162-180.

[9] MICHAN S， LI Y， CHOU M M， et al. SIRT1 is essential for normal cognitive function and synaptic plasticity[J]. The Journal of Neuroscience，2010，30（29）：9695-9707.

[10] YANG H， ZHANG W， PAN H， et a1. SIRT1 activators suppress inflanrmtory responses through promotion of p65 deacctylation and inhibition of NF-κB activity[J]. PLoS One，2012，7：e46364.

[11] JUNG Y J， LEE J E， LEE A S， et al. SIRT1 overexpression decreases cisplatin-induced acetylation of NF-κB p65 subunit and cytotoxicity in renal proximal tubule cells[J]. Biochem Biophys Res Commun，2012，419：206-210.

[12] 郭清，宮洪濤.從中醫五臟論血管性癡呆的病機[J].中國中醫藥現代遠程教育，2018，16（1）：71-72.

[13] 曾暉，胡潔.當歸小分子多糖對血管性癡呆大鼠學習與記憶功能的影響[J].中國臨床藥理學雜志，2015，31（11）：954-956.

[14] 周瑜，方銳，王國佐，等.腦泰方對SD大鼠凝血功能的影響[J].中華中醫藥學刊，2015，33（7）：1603-1605.

[15] 石詠梅，馬英民，廖君，等.內質網應激PERK通路在腦泰方提取物保護局灶性腦缺血大鼠海馬神經元中的作用[J].中國老年學雜志，2017， 37（22）：5512-5515.

（收稿日期：2018-06-20）

（修回日期：2018-07-20；編輯：華強）