電針對SAMP8小鼠學習記憶與海馬神經元NMDA受體表達的影響

駱雍陽　蔣藝燕　楊文丹　趙恩聰　李斐斐　許茜　錢長暉　董衛國

摘要：目的 觀察電針“百會”“大椎”“腎俞”對SAMP8小鼠學習記憶與海馬神經元NMDA受體NR2A和NR2B表達的影響，探討電針治療阿爾茨海默病的機制。方法 6月齡SAMP8小鼠24只，隨機分為模型組和電針組，同齡正常老化SAMR1小鼠12只為對照組。電針組電針“百會”“大椎”“腎俞”30 d。Morris水迷宮實驗檢測小鼠學習記憶能力，免疫組化染色和Western blot檢測海馬神經元NR2A和NR2B的表達。結果 與對照組比較，模型組小鼠逃避潛伏期明顯延長（P<0.01），原平臺象限停留時間明顯縮短（P<0.01），跨越原平臺次數明顯減少（P<0.01），海馬神經元NR2A相對表達量明顯升高（P<0.01），NR2B相對表達量明顯下降（P<0.01）；與模型組比較，電針組小鼠逃避潛伏期明顯縮短（P<0.05），原平臺象限停留時間明顯延長（P<0.01），跨越原平臺次數明顯增加（P<0.05），海馬神經元NR2A相對表達量明顯下降（P<0.05），NR2B相對表達量明顯升高（P<0.01）。結論 電針能改善SAMP8小鼠的學習記憶能力，其作用機制可能與電針抑制海馬神經元NMDA受體NR2A的表達和促進NMDA受體NR2B的表達有關。

關鍵詞：阿爾茨海默病；電針；NMDA受體；SAMP8小鼠

中圖分類號：R245 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2019）03-0051-05

Abstract： Objective To observe the effects of electroacupuncture （EA） at acupoints of Baihui （GV20）， Dazhui （GV14） and Shenshu （BL23） on cognitive function and neurons NMDA receptors NR2A and NR2B in the hippocampus in SAMP8 mice； To explore the mechanism of EA in the treatment of Alzheimer disease （AD）. Methods Totally 24 six-month-old SAMP8 mice were randomly divided into model group （n=12） and EA group （n=12）， and the same age SAMR1 mice were as control group （n=12）. The EA group accepted EA at Baihui， Dazhui and Shenshu for 30 days. Morris water maze was used to detect the learning and memory ability of mice. Immunohistochemical staining and Western blot were used to observe the expressions of NR2A and NR2B in hippocampal neurons. Results Compared with the control group， escape latency increased （P<0.01）， the time staying in the quadrant of the platform decreased （P<0.01）， as well as the number passing the original platform （P<0.01）， and the relative expression of NR2A increased （P<0.01） and the relative expression of NR2B （P<0.01） in hippocampus decreased in the model group. Compared with the model group， escape latency decreased （P<0.05）， the time staying in the quadrant of the platform increased （P<0.01）， as well as the number passing the original platform （P<0.05）， and the relative expression of NR2A decreased （P<0.05） and the relative expression of NR2B increased （P<0.01） in hippocampus in EA group. Conclusion EA can improve the learning and memory ability of SAMP8 mice， and its mechanism may be that the EA can inhibit the expression of neurons NMDA receptor NR2A and increase the expression of NR2B in hippocampus.

Keywords： Alzheimer disease； electroacupuncture； NMDA receptor； SAMP8 mice

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是以進行性認知功能障礙和記憶損害為主的中樞神經系統退行性疾病。其主要病理特征是細胞外β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）沉積形成的老年斑、細胞內高度磷酸化tau蛋白形成的神經纖維纏結以及神經元和突觸數量的減少。有研究報道，AD早期可見突觸功能障礙和突觸丟失，提高突觸可塑性能改善認知功能障礙[1-2]。N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR）是一種離子通道型谷氨酸受體，在突觸可塑性的調控中起非常重要的作用，參與學習和記憶的產生和維持過程[3] 。這與NMDA受體的功能單位N-甲基-D-天冬氨酸受體2A（N-methyl-D-aspartate receptor subunit 2A，NR2A）亞基和N-甲基-D-天冬氨酸受體2B（N-methyl-D-aspartate receptor subunit 2B，NR2B）亞基密切相關。我們前期研究表明，電針治療能改善快速老化模型小鼠亞系SAMP8小鼠學習記憶能力和突觸功能[4-6]。SAMP8小鼠目前被認為是一種較為完善的AD模型[7] ，已廣泛應用于AD的研究[8]。本實驗通過電針SAMP8小鼠“百會”“大椎”“腎俞”，觀察電針對SAMP8小鼠海馬神經元NMDA受體NR2A和NR2B表達的影響，探討電針改善SAMP8小鼠學習記憶能力的可能機制，為電針防治AD的臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

6月齡抗快速老化小鼠亞系SAMR1小鼠12只，雄性，體質量20～25 g，北京大學醫學部實驗動物中心提供，實驗動物質量合格證號SCXK（京）2011-0012，設為對照組；6月齡SAMP8小鼠24只，雄性，體質量20～25 g，采用隨機數字表法將其分為模型組和電針組，每組12只，北京維華阜康生物科技股份有限公司提供，實驗動物質量合格證號SCXK（京）2014-0004。飼養于福建中醫藥大學SPF級動物實驗中心，實驗前小鼠適應性喂養1個月，實驗動物均在完全一致的生活環境和飲食條件下飼養，溫度（23±1）℃，相對濕度（55±15）%，12 h光照，自由攝食飲水。實驗過程嚴格按國際動物保護及使用指南進行。

1.2 主要試劑與儀器

兔多克隆抗體NR2A（批號ab203197），Abcam；兔多克隆抗體NR2B（批號21920-1-AP），Proteintech；β-actin（批號20536-1-AP），Proteintech；生物素標記的羊抗兔IgG、DAB試劑盒，福州邁新生物工程有限公司；特超敏ECL化學發光試劑盒，碧云天生物技術公司；Motic Med 6.0數碼醫學圖像分析系統，Bio-Rad圖像分析系統。G6805-Ⅰ電針治療儀，青島鑫升實業有限公司；0.25 mm×15 mm華佗牌無菌針灸針，蘇州醫療用品廠有限公司；Morris水迷宮系統，中國醫學科學院藥物研究所；電鏡CCD相機-圖像采集分析系統，德國Soft-Imaging-System公司。

1.3 干預

電針組采用自制網兜固定小鼠，選擇“百會”“大椎”“腎俞”進行電針治療，參照《實驗針灸學》[9]取穴、定位：“百會”位于小鼠頂骨的正中，“大椎”位于背部正中（第7頸椎與第1胸椎間），“腎俞”位于第2腰椎下兩旁。具體操作方法：“百會”向前斜刺2 mm，“大椎”向下斜刺2～3 mm，“腎俞”稍向內斜刺3～4 mm，其中“大椎”“腎俞”加電針，“腎俞”雙側交替進行。進針后不進行手法刺激，連接電針治療儀，連續波，頻率2 Hz，電流強度以引起小鼠后肢肌肉輕微顫動而不嘶叫為宜。每日1次，每次20 min，8 d為1個療程，療程間隔2 d，進行下1個療程，共3個療程。模型組和對照組不進行電針治療，只進行與電針組相同方式、時間和程度的抓取和固定。

1.4 Morris水迷宮實驗

采用Morris水迷宮實驗檢測小鼠空間學習記憶能力，包括有定位航行實驗和空間探索實驗。電針治療結束后開始進行定位航行實驗。將平臺置于第三象限，沒于水下1 cm，每日上、下午各訓練4次，將小鼠分別從4個入水點（各象限池壁中點）面向桶壁放入水中，記錄小鼠爬上平臺所需時間，即逃避潛伏期，如果90 s內未找到平臺則將其引至平臺并在平臺停留10 s，記錄逃避潛伏期為90 s，連續5 d。第6日撤掉平臺，進行空間探索試驗，將小鼠從第一象限池壁中點放入池中，自由游泳90 s后結束試驗，記錄小鼠在原平臺象限停留的時間和跨越原始次數。

1.5 免疫組化染色檢測

水迷宮實驗測試結束后，每組取6只小鼠，10%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉，仰臥位固定于手術臺上，剪開胸腔，暴露心臟，從心尖插入灌注針至左心室，同時剪開右心耳。快速注入37 ℃生理鹽水80 mL，再注入4%多聚甲醛80 mL灌流固定。取全腦修塊后立刻放入4%多聚甲醛內，4 ℃固定24～48 h。常規梯度乙醇脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋。石蠟切片，厚約4 μm，經二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，將黏附腦組織載玻片置于檸檬酸修復液中，微波爐加熱修復，降至室溫。分別加入NR2A抗體和NR2B抗體，4 ℃濕盒孵育過夜。37 ℃復溫1 h后加入生物素標記的羊抗兔IgG的二抗，DAB顯色，脫水，透明，封片。用PBS代替一抗作陰性對照。用Motic Med 6.0數碼醫學圖像分析系統對海馬CA1區NR2A及NR2B的圖片進行分析，計算NR2A及NR2B的平均光密度（MOD）。

1.6 Western blot檢測

每組取6只小鼠，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，灌注針插入左心室，快速注入37 ℃生理鹽水80 mL，快速斷頭取腦，在冰浴上分離出完整海馬，存放于-80 ℃冰箱，稱左側海馬濕重，加RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑PMSF，超聲勻漿后，4 ℃、14 000 r/min離心10 min，取上清液，用BCA法測上清液濃度。蛋白樣品用6%SDS-PAGE于常溫下以30 V、20 min，80 V、30 min，120 V、50 min進行電泳。電泳結束后，4 ℃、300 mA將蛋白質從SDS-PAGE轉到PVDF膜上。轉膜后用5%脫脂奶粉在搖床上室溫封閉2 h，加入一抗（兔多克隆抗體NR2A，1∶200；兔多克隆抗體NR2B，1∶1500；抗小鼠β-actin，1∶1000），4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次×10 min；加入二抗（山羊抗兔IgG，1∶10 000），室溫下搖動孵育1 h，TBST洗滌3次×10 min。避光將顯影劑的底物A液和B液以1∶1混合后均勻覆蓋至PVDF膜上，在凝膠成像系統中拍照、觀察。目的條帶采用 Bio-Rad圖像分析軟件進行光密度積分值分析，目的蛋白與β-actin灰度值比值表示蛋白相對表達量。

1.7 統計學方法

采用SPSS20.0統計軟件進行分析。實驗數據以—x±s表示，水迷宮定位航行實驗結果進行重復測量方差分析，其他指標采用方差分析，組間比較采用兩兩比較，方差不齊時用Dunnett's t檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Morris水迷宮實驗結果

定位航行實驗：與對照組比較，模型組小鼠逃避潛伏期明顯延長（P<0.01）；與模型組比較，電針組小鼠逃避潛伏期明顯縮短（P<0.05），見表1。空間探索實驗：與對照組比較，模型組小鼠原平臺象限停留時間明顯縮短（P<0.01），跨越原平臺次數明顯減少（P<0.01）；與模型組比較，電針組小鼠原平臺象限停留時間明顯延長（P<0.01），跨越原平臺次數增多（P<0.05）。見表2、圖1。

2.2 免疫組化染色結果

與對照組比較，模型組小鼠NR2A平均光密度顯著升高（P<0.01），NR2B平均光密度值顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，電針組小鼠NR2A平均光密度顯著降低（P<0.01），NR2B平均光密度值顯著升高（P<0.01）。見表3、圖2和圖3。

2.3 Western blot檢測結果

與對照組比較，模型組小鼠NR2A相對表達量顯著升高（P<0.01），NR2B蛋白相對表達量顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，電針組小鼠蛋白NR2A相對表達量降低（P<0.05），NR2B蛋白相對表達量顯著升高（P<0.01）。見表4。

3 討論

AD屬中醫學“呆證”“健忘”等范疇，其基本病機為腎衰髓虛，髓減腦消，神機失用。AD病位在腦，根據經絡理論，“督脈者，起于下極之俞，并于脊里，上至風府，入屬于腦”（《難經·二十八難》），可見，督脈與腦密切相關，歷代醫家素有“病變在腦，首取督脈”之說。因此，從督脈調治AD越來越受到重視[10]。百會位于巔頂，其深處為腦之所在，具有醒腦開竅、安神益智的功效，是調節腦功能、治療腦部疾病的要穴。大椎是手足六陽經的交會穴，為“諸陽之會”，總督一身之陽氣，是升陽開竅、健腦調神的效穴。百會和大椎屬督脈穴，兩穴結合可使諸經通調，促進經氣運行，濡養腦髓氣血，促進陰陽平衡?！夺t學心悟》認為“腎主智，腎虛則智不足，故喜忘其前言”，唐容川《中西匯通醫經精義》指出：“事物之所以不忘，賴此記性，記在何處，則在腎精。益腎生精，化為髓，而藏之于腦中?！蹦I藏精生髓，腎俞為腎的背俞穴，腎中精氣匯集于此，具有補益腎氣、調節督脈之功；腎經與督脈相連，入髓連絡腦海。根據相關文獻[11]和我們前期研究[5-6，12]，本實驗應用“益腎調督”法，選取“百會”“大椎”和“腎俞”為治療腧穴。

針灸在防治衰老性疾病中發揮著巨大優勢，治療AD受到越來越多的重視與關注[13]。研究發現，電針“腎俞”“百會”能減少海馬Aβ沉積，降低tau蛋白的過度磷酸化，從而改善AD模型大鼠認知損傷；益腎調督針灸法可能通過減少或抑制AD大鼠血清內Aβ水平，降低大鼠海馬CA1區淀粉樣前體蛋白的表達[11] 。這與我們前期的研究[5-6，12]相一致。突觸是神經元傳遞信息的主要結構，是學習與記憶形成的重要形態學和功能學基礎[14]。研究表明，電針治療明顯增加突觸面積與體積，提高突觸素表達水平[15]，增加CA1區神經元的突觸數量，改善突觸超微結構[16]；電針“百會”“腎俞”能提升AD大鼠海馬CA1區SYN、PSD-95蛋白水平，促進突觸可塑性的增強[17]。改善突觸功能被認為是減輕AD認知損傷的有效治療方式[18]。

NMDA受體是一種重要的離子型谷氨酸能受體，廣泛分布于中樞神經系統，尤其海馬部位[19]。NMDA受體包括3種亞單位，分別是NR1、NR2（NR2A～NR2D）和NR3（NR3a、NR3b）[20]。NMDA受體在突觸可塑性的調控中起重要作用，參與學習和記憶的產生和維持過程[21]，這與NMDA受體的功能單位NR2A和NR2B亞基密切相關。研究表明，NR2A缺失的小鼠快速獲得性空間工作記憶發生了障礙，而上調NR2A的表達能損害空間工作記憶能力；NR2A基因突變小鼠表現為在新環境中自發運動增強和潛在學習能力降低[22]。NR2B亞基表達減少的大鼠表現出的學習記憶能力較正常大鼠下降，而給予上調NR2B表達的藥物可增強長時程作用，改善大鼠學習記憶能力[23]。本實驗通過免疫組化和免疫印記檢測顯示，電針組NR2A蛋白表達明顯低于模型組，NR2B蛋白表達明顯高于模型組。邱文興等[24]發現，電針治療能提高NR2B mRNA的表達，改善學習記憶能力。這與本實驗結果相一致。

我們前期研究表明，電針SAMP8小鼠“百會”“大椎”“腎俞”可提高海馬CA1區神經元突觸蛋白的表達，改善突觸的超微結構[6]。因此，結合本實驗結果，我們認為電針改善AD小鼠學習記憶能力的機制可能與電針抑制海馬神經元NR2A的表達和促進NR2B的表達相關。但是本實驗未設置非穴位組，缺少與非穴位治療的對比，將在今后實驗中進一步完善。

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（收稿日期：2018-09-06）

（修回日期：2018-09-30；編輯：華強）