巴戟天微型飲片工藝優選

2019-03-29 05:14:54魏曉峰任曉航李祥溦劉博男史輯賈天柱

中國中醫藥信息雜志 2019年3期

魏曉峰　任曉航　李祥溦　劉博男　史輯　賈天柱

摘要：目的優選巴戟天微型飲片切制工藝參數，探討其是否適用于不同產地來源的巴戟天。方法以蒸制時間、飲片長度、飲片厚度、烘干溫度為影響因素，以水晶蘭苷、去乙酰車葉草苷酸、甲基異茜草素-1-甲醚、甲基異茜草素、耐斯糖的含量及出膏率、休止角為評價指標，采用正交試驗優選巴戟天微型飲片切制工藝，并建立不同產地來源巴戟天微型飲片HPLC指紋圖譜。結果巴戟天微型飲片最佳切制工藝為：常壓蒸制軟化30 min，切片長度3 mm，切片寬度1～2 mm，40 ℃烘干。結論巴戟天微型飲片軟化切制工藝簡單易行，具有良好的適用性。

關鍵詞：巴戟天；微型飲片；切制工藝；正交試驗；高效液相色譜法

中圖分類號：R283.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2019）03-0065-06

Abstract： Objective To optimize cutting process for Morindae Officinalis Radix miniature decoction pieces； To investigate whether the cutting technology was suitable for Morindae Officinalis Radix from different producing areas. Methods Steaming time， length of decoction pieces， thickness of decoction pieces， and drying temperature were set as influencing factors， and the contents of crystal lanolin， deacetyl levulinic acid， methyl isophorin-1-methyl ether， methyl isophorin， nes sugar， and the rate of ointment and angle of repose were set as evaluation indexes. The orthogonal test was used to optimize the cutting process of Morindae Officinalis Radix miniature decoction pieces， and HPLC fingerprints of Morindae Officinalis Radix miniature decoction pieces from different producing areas were established. Results The optimal cutting process for Morindae Officinalis Radix miniature decoction pieces was steaming 30 min， then cutting into 3 mm length and 1–2 mm width， and the drying temperature was 40 ℃. Conclusion The optimal cutting process for Morindae Officinalis Radix miniature decoction pieces is easy to conduct， with good applicability.

Keywords： Morindae Officinalis Radix； miniature decoction pieces； cutting process； orthogonal test； HPLC

飲片是中藥根據需要炮制處理而成的，可直接供臨床使用。飲片質量好壞直接影響著中藥方劑、湯藥的臨床療效[1]。目前《中華人民共和國藥典》只對飲片的片、塊、絲、段、厚度等進行了相關規定，并未對飲片片型、大小等具體參數進行明確規定，因此飲片市場常遵循“以大為優”的原則[2]。規格較大的飲片并不利于中藥有效成分煎出，反而導致臨床藥效不明顯。隨著現代生活節奏的加快，中藥湯劑煎煮服用方式已不能滿足患者的需求。市場上出現了諸如顆粒、超微、配方顆粒、單味浸膏顆粒、破壁[3]等多種形式的飲片，突破了傳統飲片攜帶不方便、煎煮費時費力的局限性，但以上多種飲片形式卻忽視了一個最重要環節——共煎過程，即根據中藥相須、相使、相惡、相殺、相畏、相反的“七情”配伍規律，多種化學成分之間的反應均需在煎煮過程中完成，由此產生了微型飲片的概念。微型飲片是直徑在0.5～1.0 cm的丁塊狀飲片，其片型小于傳統飲片，煎出率高于傳統飲片[4]。我們期望通過微型飲片改革，制備出規格劃一、流動可調，能夠智能配方的飲片，使中藥調劑接近西藥調劑，較傳統飲片更有利于有效成分煎出。

本研究以“四大南藥”之一的巴戟天為對象，對其微型飲片的軟化、切制工藝進行優選。巴戟天為茜草科植物巴戟天Morinda officinalis How的干燥根，具有強筋骨、補腎陽、祛風濕功效。臨床常用于筋骨萎軟、宮冷不孕、少腹冷痛、風濕痹痛、月經不調等癥[5]。巴戟天主要含有蒽醌、環烯醚萜苷、多糖、寡糖等類成分[6]。近年來，巴戟天由于其補腎壯陽[7]、抗衰老、防抑郁[8]、調節免疫[9]等作用，成為新藥研發的熱點。巴戟天主產于廣東、廣西、福建、海南等省，不同產地巴戟天由于加工工藝不同，導致其飲片性狀差異較大，形狀、長度均不一致。因此，本研究采用正交試驗對巴戟天微型飲片的軟化、切制工藝進行研究，并建立不同產地來源的巴戟天微型飲片的特征圖譜，考察巴戟天微型飲片工藝的可行性。

1 儀器與試藥

E2695-2998型高效液相色譜儀，美國Waters公司；H-Class/Xevo TQD型三重四級桿液相質譜聯用儀（配有MassLynx色譜工作站），美國Waters公司；KQ-250DB型數控超聲波清洗器（功率250 W，頻率40 kHz），昆山市超聲儀有限公司；AE240型1/10萬電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；RE52CS型旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；HH-S4型水浴鍋，鄭州長城科工貿有限公司；101型電熱鼓風干燥箱，北京市永光明醫療儀器廠。

巴戟天藥材來自10個產地，分別為廣西玉林（S1）、廣西百色（S2）、廣東惠州（S3）、福建永定（S4）、廣東韶關（S5）、廣東梅州（S6）、廣東肇慶（S7）、福建南靖（S8）、廣東德慶（S9）、湖南湘西（S10），經遼寧中醫藥大學藥學院中藥鑒定教研室翟延君教授鑒定，均為茜草科植物巴戟天Morinda officinalis How的干燥根。

耐斯糖對照品（批號292-64121，純度≥99.0%，日本Wako公司），水晶蘭苷對照品（批號O0605AS，純度≥98.0%，大連美侖生物技術有限公司），去乙酰車葉草甘酸對照品（批號J0329AS，純度≥98.0%，大連美侖生物技術有限公司），甲基異茜草素-1-甲醚對照品（自制，純度>95.0%），甲基異茜草素對照品（自制，純度>95.0%），水為超純水，乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純（美國Merck公司），其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 耐斯糖含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備

精密稱取耐斯糖對照品1.2 mg，以甲醇-水（3∶97）定容至5 mL容量瓶中，搖勻，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備

精密稱取巴戟天微型飲片2 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，加乙酸乙酯30 mL，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，過濾，棄去濾液，濾渣揮干后加70%乙醇50 mL，相同條件下超聲處理，過濾，回收乙醇，殘渣以甲醇-水（3∶97）定容至25 mL容量瓶中，取續濾液，過0.22 ?m微孔濾膜，即得。

2.1.3 色譜條件

ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 ?m），負離子模式，流動相為0.1%甲酸-乙腈∶0.1%甲酸-水，體積流量0.3 mL/min，梯洗脫程序見表1，進樣量1 ?L。液相色譜-質譜圖見圖1。

2.1.4 線性關系考察

精密吸取耐斯糖對照品0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μL，進樣，以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程Y=207 888X-1456.92，r?=0.999 1，線性范圍為0.004 8～0.240 0 mg。

2.1.5 精密度試驗

精密吸取同一耐斯糖供試品溶液，在1 d內連續進樣6次，連續6 d同一時間分別進樣1次，進樣體積相同，測得耐斯糖日內峰面積RSD=1.7%，日間峰面積RSD=1.7%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩定性試驗

精密吸取同一耐斯糖供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h進樣，耐斯糖峰面積RSD=1.8%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.1.7 重復性試驗

取同一樣品6份，制備供試品溶液，按“2.1.3”項下條件測定，測得耐斯糖含量RSD=1.9%，表明本方法重復性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗

精密稱取已知耐斯糖含量的巴戟天微型飲片6份，每份1.0 g，按近似1∶1比例加入耐斯糖對照品，按“2.1.2”項下方法制備，計算加樣回收率。結果耐斯糖平均加樣回收率為99.10%，RSD=1.73%。

2.1.9 樣品含量測定

取各組巴戟天微型飲片，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項下條件進行測定，進樣量1 μL，記錄峰面積，計算耐斯糖含量。

2.2 水晶蘭苷、去乙酰車葉草甘酸含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備

精密稱取水晶蘭苷、去乙酰車葉草甘酸對照品各1.5 mg，用80%甲醇定容至5 mL容量瓶中，搖勻，即得。用時按1∶1比例配成混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

精密稱取巴戟天微型飲片1 g，置于150 mL具塞錐形瓶中，加80%甲醇100 mL，冷浸1 h，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）1 h，過濾，濾液減壓回收，用80%甲醇定容于10 mL容量瓶中，取續濾液，過0.45 ?m微孔濾膜，即得。

2.2.3 色譜條件

采用Venusil MP C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為甲醇-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫（5∶95→28.8∶71.2，15 min），檢測波長235 nm，體積流量0.8 mL/min，進樣量2 ?L，柱溫25 ℃[10]。色譜圖見圖2。

2.2.4 線性關系考察

精密吸取水晶蘭苷、去乙酰車葉草苷酸各2、4、6、8、10 ?L，進樣測定，以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸。結果水晶蘭苷回歸方程為Y=2 000 000X-4430，r?=0.999 9，線性范圍為0.300～1.500 mg；去乙酰車葉草甘酸回歸方程為Y=2 000 000X+16 844，r?=0.999 9，線性范圍為0.300～1.500 mg。

2.2.5 樣品含量測定

取各組巴戟天微型飲片，按“2.2.2”“2.2.3”項下方法制備供試品溶液并測定，進樣量2 ?L，記錄峰面積并計算水晶蘭苷和去乙酰車葉草甘酸的含量。

2.3 甲基異茜草素-1-甲醚、甲基異茜草素含量測定

2.3.1 對照品溶液的制備

精密稱取甲基異茜草素-1-甲醚、甲基異茜草素對照品各2.93 mg，置于5 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得。用時按1∶2比例配制成混合對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備

精密稱取巴戟天微型飲片5 g，置于150 mL圓底燒瓶中，加入80 mL氯仿，加熱回流提取2次，每次2 h，過濾，合并濾液，回收氯仿，以甲醇定容至10 mL量瓶中，取續濾液，過0.45 ?m微孔濾膜，備用。

2.3.3 色譜條件

采用Ecosil8色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m），流動相為乙腈-0.2%磷酸水，梯度洗脫程序見表2，檢測波長為277 nm，流速0.8 mL/min，進樣量20 ?L，柱溫30 ℃[11]。色譜圖見圖3。

2.3.4 線性關系考察

精密吸取甲基異茜草素-1-甲醚、甲基異茜草素對照品各3、6、10、13、16 ?L，進樣，以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸。甲基異茜草素回歸方程為Y=5 000 000X+4 000 000，r?=0.999 1，線性范圍為1.173～6.256 ?g；甲基異茜草素-1-甲醚回歸方程為Y=7 000 000X+4 000 000，r?=0.999 9，線性范圍為0.585～3.120 ?g。

2.3.5 樣品含量測定

取各組巴戟天微型飲片，按“2.3.2”“2.3.3”項下方法制備供試品溶液并測定，進樣量20 ?L，記錄峰面積并計算樣品中甲基異茜草素-1-甲醚和甲基異茜草素的含量。

2.4 出膏率測定

取不同工藝制備的巴戟天微型飲片適量，粉碎，過2號篩，精密稱取4 g，置250 mL具塞錐形瓶中，精密加入100 mL水，冷浸，前6 h內時時振搖，靜置18 h，用干燥濾器過濾，精密量取續濾液20 mL，置已干燥至恒重的蒸發皿中，水浴蒸干后，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，精密稱定。

2.5 飲片休止角測定

取一矩形盒子，裝滿巴戟天微型飲片，使其疏松程度適宜，逐漸傾斜盒子，使飲片開始流動，此時傾斜程度即為飲片休止角θ，tanθ=H/L（H為傾斜角高，L為底邊）[12]。

2.6 正交試驗設計與結果

采用正交設計方法，以飲片長度、飲片厚度、干燥溫度及蒸制時間為考察因素，每因素設置3個水平，用L9（34）正交表設計試驗（見表3）。以水晶蘭苷、去乙酰基車葉草甘酸、甲基異茜草素-1-甲醚、甲基異茜草素、耐斯糖總含量（X）及出膏率（Y）、飲片休止角（Z）為評價指標，并將其權重系數分別設定為0.4、0.4、0.2，進行正交試驗，計算綜合評分。綜合評分=0.4X/Xmax+0.4Y/Ymax+0.2Z/Zmax，其中Xmax、Ymax、Zmax為各項指標測定結果的最大值。試驗結果見表4，方差分析見表5。

由方差分析可知，蒸制時間和飲片厚度對巴戟天微型飲片切制工藝有顯著影響（P<0.05），切制長度及烘干溫度無顯著影響。綜合直觀分析及方差分析結果，最終確定巴戟天微型飲片的最佳切制工藝為：常壓蒸制30 min后進行切制，切片長度3 mm、寬度1～2 mm，40 ℃烘干。

2.7 驗證試驗

取3批巴戟天微型飲片（樣品1、2、3號）和3份巴戟天傳統飲片（樣品4、5、6號），1、2、3號樣品按“2.6”項下確定的微型飲片切制工藝制備，4、5、6號樣品按傳統飲片切制工藝（加1.0倍量水于50 ℃悶潤9 h，切段長度10～15 mm）制備[10]，分別測量耐斯糖、水晶蘭苷、去乙酰車葉草甘酸、甲基異茜草素-1-甲醚、甲基異茜草素的含量及出膏率、飲片休止角，計算綜合評分，結果見表6。可見，6份樣品綜合評分均較高，且微型飲片的綜合評分均高于巴戟天傳統飲片，與正交試驗結果相吻合，表明巴戟天微型飲片最佳工藝穩定可行。

2.8 指紋圖譜檢測方法

2.8.1 色譜條件

采用Ecosil8色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m），流動相為乙腈-0.2%磷酸水，梯度洗脫程序見表2，檢測波長277 nm，流速0.8 mL/min，進樣量20 ?L，柱溫30 ℃。

2.8.2 對照品溶液的制備

精密稱取甲基異茜草素-1-甲醚對照品2.93 mg，置于5 mL容量瓶中，甲醇定容，搖勻，即得。

2.8.3 供試品溶液的制備

取不同產地巴戟天藥材100 g，按上述最佳切制工藝，分別常壓蒸制30 min后，切成切片長度3 mm、寬度1～2 mm，40 ℃烘干，備用。精密稱取各巴戟天微型飲片2 g，置于150 mL圓底燒瓶中，分別加入80 mL氯仿，回流提取2次，每次2 h，過濾，合并濾液，回收氯仿，甲醇定容至10 mL容量瓶中，取續濾液，過0.45 ?m微孔濾膜，即得。

2.8.4 線性關系考察

精密吸取甲基異茜草素-1-甲醚對照品3、6、10、13、16 ?L，進樣，以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸，得甲基異茜草素-1-甲醚回歸方程Y=7 000 000X+4 000 000，r?=0.999 9，線性范圍為1.758～7.618 μg。

2.8.5 指紋圖譜的建立

HPLC圖譜采用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A）》軟件，生成指紋圖譜共有模式，計算相似度。標定共有峰，以甲基異茜草素-1-甲醚為參照峰，計算共有峰的相對保留時間與相對峰面積。

2.8.6 指紋圖譜相似性評價

對不同產地巴戟天微型飲片進行指紋圖譜測定，結果見圖4。以巴戟天傳統飲片色譜圖為參照譜，進行自動匹配并計算指紋圖譜相似度，結果見表7。相似度均在0.90以上。

2.8.7 指紋圖譜共有峰的標定

以巴戟天最佳微型飲片中甲基異茜草素-1-甲醚（保留時間34.056 min）的平均峰面積為參考峰，計算不同產地巴戟天微型飲片各共有峰的相對峰面積。

通過不同產地來源的巴戟天指紋圖譜測試，共分離得到62個色譜峰，其中28個為共有色譜峰，與巴戟天傳統飲片色譜圖（見圖5）相比，共有峰增加且其相對峰面積明顯增大。進一步說明巴戟天切制成微型飲片后，有效成分煎出率有所提高。

3 討論

本試驗收集的10個不同產地巴戟天藥材均來自巴戟天主要產地，經含量測定，均符合2015年版《中華人民共和國藥典》巴戟天項下耐斯糖含量測定的相關規定（耐斯糖不得少于2.0%）。

切制是傳統中藥炮制工藝的一道重要工序，也是制備微型飲片最關鍵的工序[13]。為確定微型飲片的粒徑及厚度范圍，預試驗中制備了不同粒徑、大小的飲片，并對其煎出液的有效成分含量進行監測，發現粒徑大小接近粉末的微型飲片在煎煮過程中極易糊鍋，不易過濾，因此確定飲片長度范圍為3、5、7 mm，厚度范圍為1～2 mm、2～3 mm、3～4 mm。

2015年版《中華人民共和國藥典》采用高效液相色譜-蒸發光散射檢測器對耐斯糖的含量進行測定，由于檢測器的特殊性，限制其廣泛應用。本試驗采用超高效液相色譜-四極桿高分辨飛行時間質譜法對耐斯糖的含量進行考察，本方法更加快速、準確。

休止角是評價飲片顆粒流動性的指標，也是采用自動配方機調劑飲片時的必需參數。休止角<30°表明飲片流動性好，休止角介于30°～40°表明飲片顆粒流動性可以滿足調劑基本要求，休止角>40°表明飲片流動性不好[14]。本試驗制備的巴戟天微型飲片休止角均小于30°，符合飲片流動性要求，有利于實現調劑的智能化、自動化。

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