多指標綜合評分法優選抗感膠囊提取工藝

朱廣平　戴雨晨　劉順　倪文澎

摘要：目的 優化抗感膠囊提取工藝。方法 采用單因素考察結合正交試驗設計法，以方中金銀花和連翹的有效成分綠原酸、木犀草苷、連翹酯苷A的含量和浸膏得率為綜合評分指標，考察溶劑用量、提取時間、提取次數3個因素對抗感膠囊水提工藝的影響，并進行驗證試驗。結果 最優提取工藝為：加12倍量水，回流提取2次，每次提取1.5 h。結論 本研究優選的提取工藝簡單、穩定可行，對抗感膠囊的生產工藝制定具有一定的指導意義。

關鍵詞：抗感膠囊；綠原酸；木犀草苷；連翹酯苷A；綜合評分法；提取工藝

中圖分類號：R283.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2019）03-0077-05

Abstract： Objective To optimize the extraction technology of Kanggan Capsules. Methods Single factor test combined with orthogonal test design was used， and the contents of chlorogenic acid， cynaroside and forsythoside A in Lonicerae Japonicae Flos and Forsythiae Fructus in Kanggan Capsules and extract yields were taken as comprehensive evaluation indexes to examine the effects of solvent dosage， extraction time and extraction times on the extraction technology of Kanggan Capsules. Validation test was conducted. Results The optimal extraction technology was as follows： 12 times of water extracted twice under reflux for 1.5 h each time. Conclusion The optimal extraction technology is simple， stable and feasible， which has certain guiding significance for the preparation of Kanggan Capsules.

Keywords： Kanggan Capsules； chlorogenic acid； cynaroside； forsythoside A； comprehensive evaluation method； extraction technology

抗感合劑為江蘇省中醫院院內制劑，由金銀花、連翹等12味藥組成，既有辛涼透邪清熱之效，又有芳香辟穢解毒之功，可疏散風熱、清利咽喉、清熱解毒、宣肺止咳，用于風熱感冒引起的發熱、頭痛、咳嗽、鼻塞、流涕、咽痛等，臨床應用10余年療效顯著。但合劑在使用中存在攜帶不便、順應性不好等問題。膠囊具有質量穩定、劑量準確、順應性好且便于攜帶等優點，故將抗感合劑改劑型為膠囊。為了提高有效成分含量，本試驗采用單因素與正交試驗法，以綠原酸、木犀草苷、連翹酯苷A含量及浸膏率為綜合評價指標，采用綜合評分法優化抗感膠囊提取工藝。

1 儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀，含四元泵（G1311A）、柱溫箱（G1316A）、DAD檢測器（G1314A）、工作站（Chemstation）；Kromasil 100-5-C18色譜柱（5 ?m，4.6 mm×250 mm，編號M05CLA25）；10萬分之一電子分析天平（BP-211D型，德國Sartorius）；萬分之一電子天平（AX224ZH/E，美國OHAUS Corp）；DW調溫電熱器（2000 mL，上海平環燃燒設備工程技術有限公司）；電熱套（5000 mL，上海羌強儀器設備有限公司）；KQ-1000E型醫用超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HH-4數顯型恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9123A，上海精宏實驗設備有限公司）；移液器（1000 ?L，德國Eppendorf）。

組方藥物金銀花、連翹、拳參、板藍根、綿馬貫眾、升麻、薄荷、苦杏仁、荊芥、桔梗、川芎、甘草，均購自安徽井泉中藥飲片有限公司，批號分別為20170801、20171001、20170801、20170601、20171001、20170801、20171001、20171001、20170801、20170601、20170501、20170801。綠原酸（批號Y24J7K16726）、木犀草苷（批號Y26A9H59973）、連翹酯苷A（批號Y04J8H39276）對照品，均購自上海源葉生物科技有限公司，純度均≥98%。乙腈、甲酸為色譜純（科龍化工試劑廠），水為超純水，其余試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 綠原酸含量測定

2.1.1 色譜條件

流動相：乙腈-0.4%磷酸溶液（13∶87）；檢測波長：327 nm；柱溫：30 ℃，流速：1 mL/min[1]221。

2.1.2 對照品溶液的制備

精密量取適量綠原酸對照品，用50%甲醇定容，制成濃度為193.8 ?g/mL對照品貯備液。精密量取上述貯備液1 mL于10 mL棕色瓶中，用50%甲醇定容，即得濃度為19.38 ?g/mL的對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備

取1/10處方量藥物飲片，加水浸泡提取后過濾，濾液濃縮成100 mL提取液，備用。取制備好的提取液1 mL于50 mL棕色瓶中，超聲15 min，用50%甲醇定容，0.45 ?m濾膜過濾，即得。

2.1.4 陰性對照溶液的制備

精密吸取缺金銀花和拳參的提取液1 mL，按供試品溶液制備方法制備，即得。

2.1.5 專屬性試驗

分別取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液適量，按“2.1.1”項下色譜條件測定，色譜圖見圖1。陰性對照色譜圖中，在綠原酸相同保留時間處未見相關吸收峰，表明其對測定無干擾，方法專屬性良好。

2.1.6 線性關系考察

精密量取綠原酸對照品10.24 mg，置于5 mL容量瓶中，定容至刻度，取該對照品液及稀釋2、4、6、8、10倍的對照品溶液分別進樣，以色譜峰面積為縱坐標，進樣對照品溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線并進行線性回歸，得回歸方程Y=25.032X+1949，r=0.999 7，綠原酸的線性范圍為204.8～2048 ?g/mL。

2.1.7 金銀花飲片中綠原酸含量測定

精密稱定金銀花粉末（過4號篩），按“2.1.3”項下方法制備，分別精密吸取“2.1.2”項下對照品溶液與供試品溶液各10 ?L，按“2.1.1”項下色譜條件測定，得金銀花飲片中綠原酸含量為1.9%，符合藥典規定（不得少于1.5%）。

2.2 木犀草苷含量測定

2.2.1 色譜條件

流動相A為乙腈、B為0.5%冰醋酸溶液，梯度洗脫（0～15 min，10%～20%A；15～30 min，20%A；30～40 min，20%～30%A），檢測波長為350 nm，柱溫30 ℃，流速1 mL/min[1]221。

2.2.2 對照品溶液的制備

精密量取木犀草苷對照品適量，用70%乙醇定容，制成濃度為201.2 ?g/mL對照品貯備液。精密量取上述對照品貯備液1 mL，置10 mL棕色瓶中，用70%乙醇定容，即得21.02 ?g/mL對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備

取1/10處方量藥物飲片，加水浸泡提取后過濾，濾液濃縮成100 mL提取液，備用。取制備好的提取液1 mL于50 mL容量瓶中，超聲15 min，用70%乙醇定容，0.45 ?m濾膜過濾，即得。

2.2.4 陰性對照溶液的制備

精密吸取缺金銀花的提取液1 mL，按供試品溶液制備方法制備，即得。

2.2.5 專屬性試驗

分別取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液適量，按“2.2.1”項下色譜條件測定，色譜圖見圖2。陰性對照色譜圖中，在木犀草苷保留時間處未見相關吸收峰，表明其對測定無干擾，方法專屬性良好。

2.2.6 線性關系考察

精密量取木犀草苷對照品3.91 mg，置于5 mL容量瓶中，定容至刻度。取該對照品溶液及稀釋20、40、60、80、100倍的對照品溶液分別進樣，以色譜峰面積為縱坐標，進樣對照品溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線并進行線性回歸，得回歸方程Y=32.244X-109.17，r=0.999 9，結果表明，木犀草苷的線性范圍為7.82～782 ?g/mL。

2.2.7 金銀花飲片中木犀草苷含量測定

精密稱定金銀花粉末（過4號篩），按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，分別精密吸取“2.2.2”項下對照品溶液與供試品溶液各10 ?L，進樣測定，得金銀花飲片中木犀草苷含量為0.27%，符合藥典規定（不得少于0.050%）。

2.3 連翹酯苷A含量測定

2.3.1 色譜條件

流動相：乙腈-0.4%冰醋酸（15∶85）；檢測波長：330 nm，柱溫：30 ℃，流速：1 mL/min[1]170。

2.3.2 對照品溶液的制備

精密量取連翹酯苷A對照品適量，用70%甲醇定容，制成419.2 ?g/mL對照品貯備液，精密量取對照品貯備液1 mL，置于10 mL棕色瓶中，用70%甲醇定容，即得濃度為41.29 ?g/mL的對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備

取1/10處方量藥物飲片，加水浸泡提取后過濾，濾液濃縮成100 mL提取液，備用。取制備好的提取1 mL于50 mL容量瓶中，超聲15 min，用70%甲醇定容，0.45 ?m濾膜過濾，即得。

2.3.4 陰性對照溶液的制備

精密吸取缺連翹的提取液1 mL，按供試品溶液制備方法制備，即得。

2.3.5 專屬性試驗

分別取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液適量，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，色譜圖見圖3。陰性對照色譜圖中，在連翹酯苷A相同保留時間處未見相關吸收峰，表明其對測定無干擾，方法專屬性良好。

2.3.6 線性關系考察

精密量取連翹酯苷A對照品12.045 mg，置5 mL容量瓶中，定容至刻度。取該對照品溶液和稀釋2、4、6、8、10倍的6份對照品溶液分別進樣，以色譜峰面積為縱坐標，進樣對照品溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線并進行線性回歸，得回歸方程Y=15.811X+424.48，r=0.999 4，結果表明連翹酯苷A的線性范圍為240.9～2409 ?g/mL。

2.3.7 連翹飲片中連翹酯苷A含量測定

精密稱定連翹粉末（過5號篩），按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，分別精密吸取“2.3.2”項下對照品溶液與供試品溶液各10 ?L，測定，得連翹飲片中連翹酯苷A含量為4.2%，符合藥典規定（不得少于0.25%）。

2.4 浸膏率測定

精密吸取樣品提取液5 mL，置于已干燥至恒重的蒸發皿中，在水浴上蒸干，置于105 ℃烘箱中，干燥至恒重，取出，移至干燥器內，冷卻30 min，迅速精密稱定質量。以干燥品計算供試品的浸膏得率。浸膏率（%）=固含物質量（g）÷加入供試品溶液體積（mL）×100%。

2.5 單因素考察

2.5.1 溶劑用量

在其他煎煮條件固定的情況下，分別加6、10、15倍量水，按上述方法測定煎液中綠原酸的含量。結果顯示，溶劑用量為10倍時，綠原酸含量最高；溶劑用量不足10倍量時，溶劑用量越少含量越低；溶劑用量高于10倍量時，溶劑用量越高含量越低。因此，綜合單因素考察結果，選擇8、10、12倍量溶劑進行正交試驗。

2.5.2 提取時間

在其他煎煮條件固定的情況下，分別提取30、90、150 min，按上述方法測定煎液中綠原酸的含量。結果顯示，提取時間在90 min以內，提取時間越長，綠原酸含量越高；當提取時間為150 min時，綠原酸含量甚至低于提取30 min時。綜合考慮單因素考察結果，選擇正交試驗提取時間為60、90、120 min。

2.6 正交試驗優選提取工藝

2.6.1 正交試驗設計

根據前期單因素考察結果，選擇浸膏率、綠原酸含量、木犀草苷含量、連翹酯苷A含量為考察指標，以溶劑用量、提取時間、提取次數為試驗因素，設計L9（34）正交試驗，篩選水提工藝條件。因素與水平見表1。

2.6.2 正交試驗及結果

根據“2.6.1”項下設計方案做正交試驗，得9份樣品，按上述方法分別測定3個指標成分綠原酸、木犀草苷、連翹酯苷A的含量。另取9份制備好的供試品，按“2.4”項下方法測定浸膏率。

用多指標試驗全概率法[2-3]進行數據處理，設Bi為第i號試驗，Aj為第j個指標，i=1，2，3，…，n，j=1，2，3，…，k，且A1，A2，A3，…，An互不相容，設各指標的重要程度之比為A1∶A2∶A3，…，Ar=M1∶M2，…，Mr，則：

由直觀分析結果可知，以綜合評分為考察指標，各因素的影響順序為B>C>A；由方差分析結果可知，各因素對提取工藝均無顯著影響（P>0.05）。結合直觀分析和方差分析結果，同時根據生產節能、省時的實際需要，確定優選工藝為A3B2C2，即用12倍量的水提取2次，每次1.5 h。

2.7 驗證試驗

按抗感膠囊處方比例稱取處方藥物飲片3份，按優選的提取工藝條件平行制備3份樣品。按上述方法分別測定浸膏率、綠原酸含量、木犀草苷含量、連翹酯苷A含量，結果見表4，RSD分別為1.14%、0.29%、1.63%、0.65%，表明優選出的抗感膠囊水提工藝穩定、可行。

3 討論

中藥復方制劑成分多樣，采用多指標進行綜合評分可有效避免復方制劑質量不穩定等問題。相對于單一指標成分，多指標成分評價更能反映復方的整體性、復雜性和有效性[4]。多指標綜合評分法中權重系數的賦予是綜合評分是否科學合理的表現[5-6]?？垢心z囊方中君藥為金銀花和連翹。綠原酸為金銀花的主要有效成分，故權重系數設為0.3；木犀草苷含量次之，權重系數設為0.1。連翹酯苷A是連翹的主要成分，權重系數設為0.3。中藥浸膏質量的優劣對中藥制劑成型工藝及制劑成品的質量具有重要作用[7]，因此權重系數設為0.3。驗證試驗表明，本研究優選出的抗感膠囊提取工藝條件比較合理。

本試驗僅選取主要指標成分，未能全面研究復方中藥味的成分。另外，尋找簡便、準確的多指標含量測定方法亦可為本復方的開發利用奠定基礎。

參考文獻：

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（收稿日期：2018-05-10）

（修回日期：2018-06-22；編輯：陳靜）