醬香高溫大曲、酒醅和窖泥的真菌多樣性分析

沈 毅，程 偉，鄧小波，陳 波，王 西，甘浪飛，張亞東

（四川省古藺郎酒廠有限公司，四川古藺646523）

醬香型白酒是我國的一種主要香型白酒，具有醬香突出、酒體醇厚、回味悠長和空杯留香等特點[1]。郎酒作為經典醬香型白酒的代表之一，其生產依賴傳統的高溫制曲、原料清蒸、入窖前堆積、多次發酵取酒等工藝。由于傳統的開放式生產過程及固態發酵中的不可控因素，來自高溫大曲、酒醅和窖泥的多種復雜菌種參與混合發酵，郎酒微生物菌群組成一直不夠明確，其菌群多樣性有待闡明[2-3]。早期研究集中于白酒發酵過程中高含量的細菌菌群，對其種類和多樣性進行研究，發現細菌菌群對白酒品質和風味物質形成具有重要影響[4-5]。近幾年研究發現，真菌菌群作為釀造微生物群落的重要組成部分亦具有非常重要的作用（產酒精、產酶和產香），如真菌菌群在制曲前期和高溫堆積發酵中具有高于細菌菌群的數量，且釀酒酵母是酒精生成的主要功能菌，曲霉菌和根霉菌具有很強的酯化酶和糖化酶活力，產酯酵母可形成以乙酸乙酯為主體的復合香氣[6-10]。本研究致力于探究醬香型郎酒釀造過程中真菌菌群的組成特征及其多樣性分析，為明確郎酒酒香的來源，保持酒品的穩定性奠定基礎。

目前，圍繞醬香型白酒發酵微生物的研究，多采用分離培養的方法通過表型和生理生化特征對微生物種類進行鑒定，隨后通過變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術、rRNA基因克隆文庫技術等解析微生物群落結構。鑒于一些微生物菌群不可培養的特征以及解析深度的匱乏，釀酒微生物的豐富組成和變化仍有待深入研究[11-12]。近年來，分子生物學技術廣泛應用于微生物多樣性的研究，尤其是高通量測序技術。高通量測序技術不僅具有數據量高、覆蓋面廣、準確率高的特點，還可以全面地定性和定量揭示樣品微生物菌群的多樣性和組成信息[13-14]。該技術非常適合用于白酒釀造過程中復雜微生物體系的研究。因此，本研究應用高通量測序技術，以醬香型高溫大曲、酒醅和窖泥為研究對象，解析其真菌菌落結構和多樣性，以期能夠全面準確地分析醬香型郎酒在高溫制曲、高溫堆積和多次發酵取酒的生產過程中不同材料中的真菌菌落結構和差異，為醬香型郎酒高溫制曲、高溫堆積發酵工藝的改進和完善提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

曲樣：本實驗所有樣品均采集自郎酒公司，其中高溫大曲取自貯存1個月的新制成品曲，酒醅取自第4輪次堆積的酒醅中間部分，窖泥為窖底泥，上述樣品均裝入無菌采樣袋后置于低溫保存。

耗材及試劑：高質量DNA提取試劑盒Power-Soil DNA Isolation Kit購自美國MO Bio公司，微生物高通量測序建庫試劑盒購自北京百邁克公司，Phusion HF MM高保真PCR酶購自美國BioLabs公司，MinElute?PCR Purification Kit購自德國Qiagen公司，Sample Preparation Kit購自美國Illumina公司，Taq DNA Polymerase購自北京全式金公司，電泳相關試劑購自北京全式金公司，引物（ITS1-F1：5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'/ITS1-R1：5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）合成于北京華大公司等。

儀器設備：Illumina HiSeq 2500測序平臺，美國Bio-Rad公司；S1000 PCR儀，美國Bio-Rad公司；CFX96熒光定量PCR儀；美國伯樂BIO-RAD Gel Doc?XR+凝膠成像系統；北京六一儀器廠DYY-8C水平電泳槽；德國IKA公司VORTEX-3旋渦混勻器；德國Eppendorf公司Research Plus移液器；德國Beckman公司Allegra X-22R低溫冷凍離心機；日本三洋公司超低溫冰箱，準微量分析天平BT25S；德國Eppendorf BioPhotometer Plus核酸蛋白測定儀；美國Thermo公司NanoDrop 2000超微量分光光度計；優普UPT純水機等。

1.2 試驗方法

1.2.1 高溫大曲、酒醅和窖泥的菌群基因組DNA提取

本實驗基因組DNA提取按照PowerSoil DNA Isolation Kit說明書進行，其中裂解步驟如下：首先將樣品置于滅菌烘干的研缽中，加入液氮研磨制備大小均一的粉末，準確稱取0.25 g各樣品至Power-Bead Tubes中，加入裂解液Solution C1后，在最大轉速3200 r/min下連續渦旋振蕩15 min，經碳化硅研磨珠的機械力和裂解液的化學反應共同作用下，充分裂解微生物，之后按說明書對微生物宏基因組DNA進行提取。

1.2.2 高溫大曲、酒醅和窖泥的菌群DNA文庫建立與測序分析

高溫大曲、酒醅和窖泥的菌群基因組DNA用0.8%的瓊脂糖電泳檢測，利用超微量分光光度計測定其OD260/280值及其含量。同時我們設計了特異性引物（ITS1-F1/ITS1-R1）進行PCR擴增，PCR擴增程序為：95℃預熱5 min；95℃變性30 s，50℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共計30 cycles；72 ℃延伸10 min，PCR產物經1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增目標產物的大小和條帶信息。

各樣品菌群DNA經質量檢測合格后，通過針對ITS1區域的特異性引物分別進行PCR擴增。PCR擴增使用Phusion HF MM高保真PCR酶，PCR條件如下：98℃預熱1 min；98℃變性10 s，50℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共計30 cycles；最后72 ℃延伸5 min。PCR結束后，利用Qiagen公司的Min-Elute?PCR Purification Kit，按照試劑盒說明書進行PCR產物純化。針對純化產物，我們利用Illumina公司的Tru-Seq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit制備測序文庫并添加接頭序列，文庫經過Thermo NanoDrop 2000測定質量后，利用Illumina HiSeq 2500進行高通量測序。

1.2.3 生物信息學分析

利用FLASH[15]對測序獲得的原始數據進行拼接，之后使用Trimmomatic[16]軟件對拼接得到的序列進行質量過濾，并去除嵌合體（UCHIME[17]），獲得高質量的Tags序列。利用UCLUST[18]軟件在相似性97%的水平上對序列進行聚類，以測序所有序列數的0.005%作為閾值過濾OTU[19]?；赨NITE[20]和RDP（Ribosomal Database Project）[21]對 OTU 進行分類學注釋分析，同時計算該OTU在各樣品中的相對含量、利用ClustalW2[22]軟件以鄰接法進行系統進化樹分析，利用Mothur[23]軟件對樣品進行Alpha多樣性分析等。

2 結果與分析

2.1 菌群基因組DNA的提取及ITS擴增

如表1所示，本實驗成功從高溫大曲、酒醅和窖泥中制備高質量的菌落基因組DNA模板，其OD260/280值在1.8～1.9之間，含量均高于50 ng/μL。由圖1A可見，各菌落基因組DNA在電泳圖中有非常清晰的單一條帶，表1和圖1結果說明，成功提取獲得高質量的DNA。如圖1B所示，從3個樣品中各取用20 ng基因組DNA作為模板，利用靶向ITS1序列的特異性引物，從高溫大曲、酒醅和窖泥的基因組DNA中擴增得到大小約250 bp的條帶，符合預期片段大小，可以進行后續建庫測序實驗。

表1 菌群基因組DNA的OD260/280值及濃度

圖1 基因組DNA和ITS1基因片段擴增的電泳結果圖

2.2 樣品測序數據處理結果

本研究收集的郎酒高溫大曲、酒醅和窖泥樣品共產出598,550對reads，雙端reads拼接、過濾后共產生236,402條clean tags，平均每個樣品產出78,801條clean tags（見表2）。去除引物和barcode后的序列平均長度分別為304 bp、258 bp和280 bp，Q30(%)為質量值大于或等于30的堿基占總堿基數的百分比，3種樣品的Q30值均高于96%，說明數據質量較高。

表2 樣品測序數據處理結果統計

2.3 序列豐度和多樣性分析

如圖2所示，在97%的相似度水平下，針對236,402條代表性序列進行聚類得到的各樣品OTU個數分別為83、70和308，合計OTU數量為350個。同時對3種樣品真菌菌群的構成進行比較分析，繪制得到的OTU-Venn圖如圖3所示，其中高溫大曲、酒醅和窖泥共有的OTU個數為13，高溫大曲和酒醅共有的OTU個數為25，高溫大曲和窖泥共有的OTU個數為63，酒醅和窖泥共有的個數為46，而高溫大曲、酒醅和窖泥特有的OTU個數分別為8個、22個和222個。

圖2 高溫大曲、酒醅和窖泥樣品中OTU個數分布圖

圖3 高溫大曲、酒醅和窖泥樣品的OTU-Venn圖

同時，經Alpha多樣性分析得到高溫大曲、酒醅和窖泥微生物的豐度指數（Chao1）和多樣性指數（Shannon），其中三者的Chao1指數分別為123、91和 310，而 Shannon指數分別為 1.122、1.764和4.239。由此可見，郎酒窖泥中真核微生物具有最高的豐富度和多樣性，豐富度其次是高溫大曲和酒醅，但是酒醅中真核微生物的多樣性高于高溫大曲。

不同樣品用不同顏色表示，不同顏色圖形之間交疊部分數字為兩個樣品之間共有的OTU個數，多個顏色圖形之間交疊部分數字為多個樣品之間共有OTU個數，非交疊部分為各樣品特有OTU個數。

2.4 基于各分類學地位對高溫大曲、酒醅和窖泥的分析

在OTU劃分的基礎上，通過將OTU代表序列與微生物參考數據庫進行比對分析，本研究對高溫大曲、酒醅和窖泥進行分類學鑒定（表3），將序列鑒定為5個門，16個綱，40個目，77個科，109個屬和148個種，其中仍有部分序列經過比對無法鑒定到已知的屬和種。

表3 郎酒高溫大曲、酒醅和窖泥樣品的各分類學地位數量統計

針對樣品中平均含量大于1%的真菌在屬和種水平上進行相對含量比較分析，在350個OTU中，平均相對含量＞1%的OTU有20個，其中包含4個無法比對到已鑒定真菌菌屬的未知OTU。在已知的屬水平上，高溫大曲中的優勢菌屬主要隸屬于嗜熱絲孢菌屬（Thermomyces）、曲霉屬（Aspergillus）和嗜熱子囊菌屬（Thermoascus），其平均相對含量分別為54.9%、24.2%和18.5%；酒醅中的優勢菌屬主要為假絲酵母屬（Candida）、擬青霉屬（Paecilomyces）和嗜熱絲孢菌屬（Thermomyces），其相對含量分別為55.1%、16.5%和15.1%；窖泥中的主要菌屬為馬拉色菌屬（Malassezia）、被孢霉屬（Mortierella）、枝孢屬（Cladosporium）和曲霉屬（Aspergillus），其相對含量分別為17.7%、10.1%、6.5%和5.3%。

在已知的種水平（圖4），高溫大曲的主要菌種包括疏棉狀嗜熱絲孢菌Thermomyces lanuginosus（54.9%）、曲霉屬的Aspergillus cibarius（24.2%）和熱子囊菌屬的Thermoascus sp.（18.5%）；酒醅中的主要菌種包括假絲酵母屬的Candida xylopsoci（52.3%）、擬青霉屬的Paecilomyces formosus（16.5%）和疏棉狀嗜熱絲孢菌Thermomyces lanuginosus（15.1%）；而窖泥中的優勢菌種包含限制性馬拉色菌Malassezia restricta（17.3%）、枝孢屬的Cladosporium halotolerans（4.4%）、被孢霉屬的Mortierella antarctica（3.9%）和雜色曲霉Aspergillus versicolor（3.5%）。

圖4 在種水平上高溫大曲、酒醅和窖泥中優勢真菌相對含量的比較分析

3 結論

本研究采用HiSeq 2500高通量測序技術，對郎酒高溫大曲、酒醅和窖泥樣品中的真菌微生物進行解析，研究顯示三者之間的真菌菌群組成和多樣性存在明顯差異。

高溫大曲作為醬香型白酒發酵中微生物的主要來源，掌握其中的主要風味微生物的種類和數量對于提高白酒的品質具有重要意義。鑒于醬香型郎酒高溫制曲的特殊工藝，本研究發現,在高溫大曲真菌微生物中，嗜熱型真菌菌屬占優勢地位，其中嗜熱絲孢菌屬（Thermomyces）和嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）真菌的比例合計高達73.4%，上述結果與蔣英麗等[24]的最新研究報道相一致，通過追蹤不同階段的高溫大曲微生物組成，研究發現，高溫對醬香功能菌群的篩選和富集效應明顯，在新制成品曲和儲存曲塊中，嗜熱菌屬具有非常高的相對含量。本研究中疏棉狀嗜熱絲孢菌Thermomyces lanuginosus不僅在高溫大曲中占據了高達55%的比例，也在酒醅和窖泥菌群中得到鑒定（15.1%和0.4%），而該菌種同樣廣泛存在于醬香型茅臺酒發酵過程中[25]，以及濃香型大曲[26]和瀘州老窖大曲中[27]。Thermomyces lanuginosus的生長溫度據報道可以達到真菌生存的最高溫度60℃，該類群真菌可以分泌β-木聚糖酶，將植物細胞壁的主要組成成分木聚糖轉化成木糖等[28-29]。此外，在高溫大曲中還存在較高豐度的曲霉屬（Aspergillus）真菌微生物，該菌屬微生物廣泛應用于醬油、日本清酒、中國黃酒等傳統釀造行業，具有一定的耐酸能力，可分泌糖化酶，具有較高糖化力，可提高出酒率[30-31]，而在郎酒醬味相關研究中亦推測高溫曲霉在醬香獨特風味產生上具有重要的地位[2]。上述高溫大曲中的研究顯示，嗜熱菌屬和曲霉屬在高溫大曲中占據很高的豐度，對高溫大曲的獨特風味物質的組成和含量具有重要的影響。

酒醅在堆積過程中不僅利用來自高溫大曲中已存在嗜熱微生物菌屬，還會吸附來自于空氣和生產環境中的微生物，同時在堆積過程中的高溫可再次對優勢菌群進行富集，增加酒醅中風味物質的種類和含量，表明了酒醅中可形成獨特的產菌群成分。在酒醅的真菌微生物分析中，研究發現，優勢菌種包括假絲酵母屬的Candida xylopsoci（52.3%）、擬青霉屬的Paecilomyces formosus（16.5%）和疏棉狀嗜熱絲孢菌Thermomyces lanuginosus（15.1%），其中，假絲酵母屬的Candida xylopsoci占據絕對主導地位，該菌種在釀造過程中作為主要的產酒功能菌發揮重要作用，同時，張春林等[32]在瀘州高溫大曲中篩選到酵母菌GY-3（即Candida xylopsoci）可作為產香的功能菌。Candida xylopsoci在新疆塔城牧區奶酪樣品中及乳清和凝乳中作為主要菌種存在[33]，同時作為優勢菌種存在于寧紹地區的特色腌制蔬菜腌制冬瓜中[34]。因此，我們推測假絲酵母屬的Candida xylopsoci在郎酒堆積發酵過程可能參與香味物質的生成等，對于醬酒特殊性風味的形成具有重要的作用。對比醬香型郎酒高溫大曲和酒醅的分析結果，揭示二者之間的優勢菌群存在一定的異同。其中，嗜熱絲孢菌屬（Thermomyces）在大曲和酒醅均可作為優勢菌屬，而酒醅中的其他優勢菌屬則由假絲酵母屬和擬青霉屬組成。我們推測，盡管酒醅中含有少量成品曲粉導致其與高溫大曲微生物菌群的初始組成非常相似，且堆積過程中酒醅核心溫度接近高溫制曲溫度，但是制曲過程采用生料，而酒醅發酵采用蒸煮后富含水分的熟料，即高溫大曲和酒醅中微生物處于兩種差異顯著的培養發酵環境，因此可導致二者微生物組成存在較大差異。

窖泥作為醬香型白酒發酵過程中的重要組成部分，其所在的窖池窖齡越長，其富集的功能微生物越多，風味物質越豐富，而目前的應用集中于窖泥微生物的復合應用上，可有效提高原酒優質品率等[11]。窖池作為酒醅發酵的主要場所，提供獨特的厭氧環境，并通過窖泥提供豐富的釀造微生物，產生多種對酒體有貢獻的風味成分[35]。本研究發現，在相同含量的基因組DNA模板中，窖泥樣品中通過建庫測序得到的有效reads數最少，ITS1片段的擴增條帶含量最少，表明窖泥中真核微生物占總微生物含量的比例相對于高溫大曲和酒醅較低。有研究亦表明，在濃香型白酒發酵窖泥微生物中，原核微生物總類和豐度高于真核微生物，占據主導地位[36]。盡管窖泥真核菌群在總微生物中未占據優勢地位，但本研究揭示窖泥中真核微生物的豐富性和多樣性遠高于高溫大曲和酒醅，在所有鑒定到的305個OTU中，屬水平上相對含量超過1%的OTU有16個，呈現出豐富的真核微生物多樣性，與高溫大曲和酒醅中少數幾個優勢菌屬占據超過近80%相對含量的現象存在顯著差異。同時，本研究發現，窖泥中的主要菌屬為馬拉色菌屬（Malassezia）、被孢霉屬（Mortierella）、枝孢屬（Cladosporium）和曲霉屬（Aspergillus），上述菌屬亦同樣存在于其他白酒真核微生物組成中，參與白酒釀造過程中復雜的物質能量代謝和物質形態變化過程[36-38]。

綜上所述，本研究采用高通量測序技術，對醬香型郎酒生產中的高溫大曲、酒醅和窖泥的真菌微生物進行多樣性解析和比較分析，結果顯示，三者在真菌微生物多樣性和組成上存在較大差異，其中窖泥中微生物豐富度和多樣性最高，在窖泥中可以鑒定到大量共同存在于高溫大曲和酒醅中的真菌菌種；高溫大曲中主要由優勢菌屬嗜熱絲孢菌屬（Thermomyces）和嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）組成；酒醅中優勢菌屬包括假絲酵母屬（Candida）、擬青霉屬（Paecilomyces）和嗜熱絲孢菌屬（Thermomyces），與高溫大曲和窖泥的微生物組成存在顯著差異。同時，本研究在郎酒高溫大曲、酒醅和窖泥中鑒定到部分無法比對到已知序列的菌屬和菌種，表明郎酒釀造過程中可能存在與風味和品質相關的獨特未知菌種，后續還將開展更深入的研究進行解析。