高溫大曲發酵過程中微生物多樣性研究

付紹鴻，趙榮壽，楊 柳，周 藺

（四川省古藺郎酒廠有限公司，四川古藺646523）

“曲是酒之骨”，酒曲的好壞直接影響著酒的產量和質量。不同類型大曲內微生物和酶類的組成與其具體的制曲生產工藝和地理環境息息相關。從宏觀上看，不同香型大曲之間的差異主要是受環境條件（溫度、濕度等環境因素）和制曲工藝措施的影響；從微觀角度看，其本質是受各大曲中微生物種群組成和豐度，以及由此產生的符合酶系組分配比差異的影響。因此，從微生物學角度比較不同香型間的相互作用規律，具有較為重要的意義。

高通量測序技術是近幾年發展起來的具有里程碑式的測序技術，其在微生物生態學研究中具有無可比擬的優勢，隨著測序費用的降低，該技術越來越多的替代DGGE、ARDRA等傳統免培養技術。本文通過最新的高通量測序技術，對郎酒高溫大曲制曲及儲藏階段微生物區系變化開展研究，為指導高溫大曲功能微生物篩選應用、優化提升大曲制作工藝提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

高溫大曲樣品：取自四川省古藺郎酒廠有限公司，分別為入倉、翻曲、儲存1個月、儲存2個月4個時間段的同一批樣品。塊狀曲藥取樣方法采用分層法，粉碎后曲藥取樣采用四分法。

儀器設備：2P-200型恒溫振蕩器，江蘇太倉市實驗設備廠；YM-1000CT恒溫超聲儀，上海豫明儀器有限公司；TGL20M-Ⅱ冷凍離心機，湖南凱達科學儀器有限公司；5810R臺式冷凍離心機，德國Ep-pendorf公司；2720 thermal cycler PCR儀，Applied Biosysterms；DYCP-31 DNA電泳槽，北京六一儀器廠；DYY-5穩壓電泳儀，北京六一儀器廠；FR980凝膠成像儀，上海復日科技儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 大曲總DNA提取

大曲DNA提取方法參照葉光斌等的提取方法。

1.2.2 細菌的PCR擴增

細菌16S rRNA基因的PCR擴增所用引物為338F（5’-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG-3’）/806R（5’-ACT CTA CHV GGG TWT CTAAT-3’）；PCR反應體系為：PCR緩沖液（5×FastPfu Buffer）0.4 μL，2.5 mM dNTPs 0.2 μL，正反向引物（5 μM）各0.8 μL，DNA聚合酶（FastPfu Polymerase）0.4 μL，BSA0.2 μL，模板DNA10 ng，加雙蒸水補齊至20 μL；PCR反應參數為：95℃預變性3 min，以下27個循環包括95℃預變性30 s；然后55℃退火30 s；72℃延伸45 s，最后一個循環72℃延伸10 min。通過對原始數據的篩選審查，得到優化序列，從而使序列質量提高，使分析的結果更具有可靠性。利用測序平臺通過雙末端測序（PE sequencing），可以將基因序列進行初級篩選，剔除測序質量較差的數據。通過barcode找對應編號樣本，去掉引物，再把質量較差的序列剔除。基于序列相似度的方法，用Mothur等軟件將序列劃分為不同的OTU；對于核糖體序列，通常以≥97%的相似度確定為同一OTU。用RDP數據庫當中序列的集合做對比，對單個OTU的分類信息進行歸類。通過獲取OTU信息，可以對文庫進行統計學分析。

2 結果與分析

2.1 高通量測序及數據分析

經檢測及PCR擴增，大曲DNA含量及PCR擴增產物的電泳結果見表1和圖1。

從表1和圖1可看出，大曲樣品均獲得有效提取和有效擴增，可滿足后續高通量測序要求。

2.2 高通量原始數據獲取

通過對21個樣品細菌16S rRNA基因文庫的高通量測序，共獲得662525條序列，每個文庫均獲得20000條以上的測序序列，有效的保證了測序的覆蓋率；各文庫的覆蓋率均達到99.9%以上。各樣品測序數目、OTU數目、文庫覆蓋率和香農多樣性指數見表2。

表1 不同大曲樣品提取的DNA含量及OD值檢測

圖1 大曲PCR擴增結果和膠回收結果

從表2看出，隨著大曲發酵時間的推進，大曲內細菌的多樣性呈現波浪形變化，OTU數目在53～131之間，香農多樣性指數在1.13～2.25之間。其中樣品7的細菌多樣性最為豐富，樣品18的樣品多樣性最少。

2.3 不同大曲樣品細菌多樣性分析

為了得到每個OTU對應的物種分類信息，采用RDP數據庫對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，并在各個水平統計每個樣品的群落組成。選擇細菌16s細菌核糖體數據庫Silva作為參比數據庫。分別在門、綱、目、科、屬的層次下對各樣品的物種分布進行統計（見圖2—圖6）。

從圖2可以看出，樣品1—3的微生物種群主要是厚壁菌門和變形桿菌門微生物，隨著發酵的進行，放線菌門的出現，變形菌門降低，到了發酵后期，厚壁菌門成為主要優勢種群。

圖2 不同大曲樣品門級水平分布

由此可得，厚壁菌門在整個大曲發酵過程和儲存中起關鍵作用，而變形菌門在發酵前期作用較明顯。

圖3 不同大曲樣品綱級水平分布

如圖3所示，在綱級水平上，1—3號大曲占優勢的為芽孢桿菌綱和變形桿菌綱，4—9號大曲占優勢為芽孢桿菌綱和放線菌綱，在整個發酵和儲存過程中芽孢桿菌綱的豐度值最高，約占全部物種的90%以上。

由此可得，芽孢桿菌綱在整個大曲發酵過程和儲存中起關鍵作用，而變形桿菌綱在發酵前期作用較明顯。

如圖4所示，在目級水平上，大曲發酵前期乳桿菌目和腸桿菌目占優勢，隨著發酵的進行，芽孢桿菌目的豐度值逐漸增大，發酵中后期約占全部物種的90%以上。

圖4 不同大曲樣品目級水平分布

由此可得，芽孢桿菌目在整個大曲發酵中后期過程和儲存中起關鍵作用。發酵前期起主要作用的是乳桿菌目。

圖5 不同大曲樣品科級水平分布

如圖5所示，大曲發酵前期腸桿菌科、乳桿菌科和明串珠菌科占優勢，隨著大曲發酵的逐漸推進，發酵中后期和儲存過程中，芽孢桿菌科和高溫放線菌科豐度值逐漸增加。

由此可得，腸桿菌科、乳桿菌科和明串珠菌科主要作用于大曲發酵前期，芽孢桿菌科和高溫放線菌科在大曲發酵中后期和儲存過程中起關鍵作用。

如圖6所示，大曲發酵前期乳桿菌屬和魏斯氏菌屬占優勢，隨著大曲發酵的逐漸推進，發酵中期厭氧芽胞桿菌屬和糖多孢菌屬占優勢，發酵后期及儲存過程中，Lentibscillus和Kroppenstedtia占主要優勢。

圖6 不同大曲樣品屬級水平分布

3 結論

本文利用高通量測序技術對發酵和儲存過程中的微生物區系變化進行了初步分析，分析結果顯示：

（1）隨著大曲發酵時間的推進，大曲內細菌的多樣性呈波浪形變化；

（2）在門級水平上，厚壁菌門在整個大曲發酵過程和儲存中起關鍵作用，而變形菌門在發酵前期作用較明顯；在綱級水平上，芽孢桿菌綱在整個大曲發酵過程和儲存中起關鍵作用，而變形桿菌綱在發酵前期作用較明顯；在目級水平上，大曲發酵前期乳桿菌目和腸桿菌目占優勢，芽孢桿菌目在整個大曲發酵中后期過程和儲存中起關鍵作用；在科級水平上，腸桿菌科、乳桿菌科和明串珠菌科主要作用于大曲發酵前期，芽孢桿菌科和高溫放線菌科在大曲發酵中后期和儲存過程中起關鍵作用；在屬級水平上，乳桿菌屬和魏斯氏菌屬在大曲發酵前期占優勢，厭氧芽胞桿菌屬和糖多孢菌屬在大曲發酵中期占優勢，Lentibscillus和Kroppenstedtia在大曲發酵后期及儲存過程中占優勢。