芝麻香型白酒中健康功能因子四甲基吡嗪測定方法的對比研究

司冠儒，張溫清，饒志明，于海波，孔 帥，段亮亮，葉 明，周 萍

（1.安徽宣酒集團股份有限公司，江南小窖釀造工藝研究所，安徽宣城242000；2.合肥工業大學，食品科學與工程學院，安徽合肥230009；3.江南大學生物工程學院，工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫214122）

吡嗪類化合物是一類含1,4-二氮雜苯母環化合物的總稱，廣泛存在于自然和發酵食品中，具有類似于炒堅果、烤肉的怡人香氣，香氣透散性好，對其他香味有顯著的烘托和疊加作用。四甲基吡嗪(TTMP)，又名川芎嗪，是一種重要的吡嗪化合物。它作為中藥材川穹根莖的主要活性生物堿成分，具有特殊的藥理作用。研究表明，TTMP具有擴張血管、改變血循環、護肝（防止酒精對胃黏膜和肝臟的損傷）等功能[1-2]。醬香型、兼香型和芝麻香型白酒中富含吡嗪類物質，特別是TTMP，其主要由發酵過程中微生物代謝產生，是中國白酒中的健康風味成分，為“適量飲酒，有益健康”提供了依據[3-4]。

近年來，針對白酒中TTMP檢測方法的研究已有很多的相關報道，氣相色譜技術、液相色譜技術及氣質聯用技術均應用于該領域中[5-7]。建立簡便準確的TTMP含量測定方法，對進行白酒中TTMP的研究工作，白酒廠日常的分析檢驗及自身品牌提升具有重要的意義。本研究團隊前期針對芝麻香型白酒中TTMP做了系統的研究，相繼開發了TTMP檢測的氣相色譜法、液相色譜法和液相色譜質譜聯用法，并對芝麻香型白酒整個生產工藝過程中TTMP的產生機理進行了深入的研究[8-11]。本文擬對氣相色譜技術、液相色譜技術和液相色譜質譜聯用技術定量檢測芝麻香型白酒中TTMP的方法進行研究，分析3種方法的優缺點，以期為不同兄弟廠家根據自身的設備配置和人員素質建立TTMP的日常分析檢測方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒樣：待測酒樣均為本廠產芝麻香型白酒。

儀器設備：氣相色譜儀，日本SHIMADZU GC-2010 Plus，配有 FID 檢測器；色譜柱，Varian，CP 97723A，50 m×0.25 mm×0.39 mm；氫氣發生器QL-500，山東賽克賽斯氫能源有限公司；空氣發生器HGA-5L，北京匯龍公司；高純氮氣，南京特種氣體有限公司；液相色譜儀，美國Angilent 1200；色譜柱，Phenomenex Gemini 5 μm C18110A(250×4.60 mm)；液相色譜質譜聯用儀，美國Angilent 1260-6460；色譜柱，Angilent Eclipse Plus C183.5 μm(4.6×100 mm)；電子天平，上海梅特勒-托利多儀器有限責任公司；微量進樣器，日本SHIMADZU。

試劑：內標2-乙基丁酸，購于天津市光復精細化工研究所；TTMP（2,3,5,6-TTMP）購自sigma公司；色譜級乙醇、甲醇購于ANPEL公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標樣的制備

準確稱取一定量的TTMP于容量瓶中，用60%的色譜級乙醇溶解并定容。

1.2.2 酒樣的測定

5 mL的酒樣中加入0.1 mL 2%（v/v）的2-乙基丁酸，混勻，取約1 mL至樣品瓶中，直接用于氣相色譜分析。

吸取3 mL待測酒樣，經0.22 μm濾膜過濾后取約1 mL至樣品瓶中，直接用于液相色譜和液相色譜質譜聯用分析。

1.2.3 定性與定量方法

氣相色譜分析：通過TTMP標樣測定的保留時間及標樣組分直接添加來進行定性分析；通過在試樣中添加內標溶液對待測組分進行定量分析。

液相色譜分析：通過TTMP標樣測定的保留時間及標樣組分直接添加來進行定性分析；通過外標法對待測組分進行定量分析。

液相色譜質譜聯用分析：通過TTMP標樣測定的保留時間及標樣組分直接添加來進行定性分析；通過外標法對待測組分進行定量分析。

2 結果與分析

2.1 白酒樣品中TTMP氣相色譜法檢測條件的確定（圖1）

圖1 氣相色譜法TTMP標準樣品色譜圖

氣相色譜分析時，TTMP在乙酸后出峰，乙酸在酒中含量較高，在色譜圖中峰展寬度較大。通過研究，發現載氣流量、分流比、程序升溫的起始溫度及升溫速率對二者的分離效果均產生極其重大的影響，尤其是程序升溫速率。程序升溫速率過慢，容易造成乙酸峰拖尾，TTMP分離效果不好；程序升溫速率過快，則影響TTMP與其后的微量成分的分離，且易對色譜柱造成損害，縮短柱子的使用壽命。經過多次實驗，確定了最優的色譜條件：進樣量為1 μL；載氣為氮氣，流速為0.7 mL/min；分流比為20∶1；進樣口溫度為230℃；檢測室溫度為240℃；程序升溫起始溫度40℃，保持3.0 min，然后以15℃/min的升溫速率升溫至200℃，保持20.0 min。在此條件下，TTMP的分離狀況，色譜的運行時間均為最佳。TTMP標樣色譜圖見圖1，TTMP的保留時間為18.207 min。

2.2 白酒樣品中TTMP液相色譜法檢測條件的確定（圖2）

圖2 液相色譜法TTMP標準樣品色譜圖

查閱相關文獻及對TTMP標樣的全波長走讀掃描發現，TTMP在278 nm處具有最大的特異吸收峰，從而確定其液相檢測波長。對甲醇濃度、色譜柱溫度及流速進行了優化，確定了白酒中TTMP檢測的最佳色譜條件。當70%甲醇作為流動相時，目標峰的峰形較為對稱，響應也較好，但保留時間過短，TTMP易受白酒中其他基質的影響，降低甲醇的濃度可使TTMP的保留時間延長，同時也會降低其響應。本研究經過多次實驗，確定了流動相中甲醇的最佳濃度為35%。根據標樣中TTMP的保留時間及在酒樣中添加一定量的標準樣品，對酒樣中的TTMP進行了定性。TTMP標樣色譜圖如圖2所示，TTMP的保留時間為16.401 min。

最佳色譜檢測條件：流動相為甲醇∶水（v/v）=35∶65，流速為1 mL/min，柱溫為35 ℃，色譜柱為phenomenex Gemini 5 μm C18110A(250×4.60 mm)，進樣量為20 μL。白酒樣品過0.22 μm濾膜后，直接進樣。

2.3 白酒樣品中TTMP液相色譜質譜聯用法檢測條件的確定（表1、圖3）

表1 MRM檢測參數表

圖3 液質聯用法TTMP標準樣品色譜圖

表2 3種方法的相對標準偏差(RSD)和回收率

液相色譜質譜聯用法檢測條件HPLC條件部分參考了2.2。基于ESI+對流動相的要求，在水相中加入0.1%甲酸，以利于TTMP的離子化，最終確定流動相組成為乙腈∶0.1%甲酸=35∶65，TTMP的響應值與分離度均較好，同時保留時間也較短；MS/MS方法參數部分，裂解電壓(Fragmentor Voltage)主要影響毛細管末端進入MS1的母離子的豐度，碰撞能（Collision Energy）主要影響碰撞池中產生的子離子的豐度，通過對這兩個參數的優化，最后確定的MRM參數見表1。該分析條件下TTMP標準樣品的色譜圖和質譜圖見圖3。

2.4 3種方法測定TTMP的精密度分析

在酒樣中添加不同濃度的TTMP，3種方法分別進行測定，驗證3種方法檢測白酒中TTMP的回收率、精密度。氣相色譜法檢測白酒中TTMP的回收率為93.33%～98.44%，相對標準偏差RSD為5.39%～3.05%；液相色譜法檢測白酒中TTMP的回收率為94.67%～100.33%，相對標準偏差RSD為4.00%～2.36%；液質聯用法檢測白酒中TTMP的回收率為95.33%～99.67%，相對標準偏差RSD為3.20%～1.76%（表2）。由上述數據可知，3種方法檢測芝麻香型白酒中TTMP的重復性和精確度均較好，可以滿足白酒廠日常檢測分析的要求。

3 結論

建立了用氣相色譜法、液相色譜法和液相色譜質譜聯用法檢測芝麻香型白酒中的健康功能因子TTMP的方法，并對3種方法檢測TTMP的回收率和精密度進行了研究。回收率和相對標準偏差數據結果顯示，3種方法測定芝麻香型白酒中TTMP的回收率和精密度均可以滿足檢驗的要求。在日常檢驗工作中發現，利用氣相色譜法測定芝麻香型白酒中的TTMP，隨著進樣數目的增多，柱效下降，芝麻香型白酒中的乙酸含量較高，造成乙酸在色譜圖中峰展較寬，甚至拖尾，容易影響出峰順序在其后的TTMP的分析測定。液相色譜法和液相色譜質譜聯用法測定芝麻香型白酒中TTMP時，TTMP響應較高，出峰前后沒有其他風味物質的干擾，定性定量更為準確。且樣品無需前處理直接進樣，操作簡便，其中液相色譜法對儀器設備和技術人員的素質要求較低，更便于推廣。但對于白酒生產工藝過程中基質較為復雜，且TTMP含量較低的曲粉、糟醅等樣品，液相色譜質譜聯用法具有檢出限更低，靈敏度更高，假陽性低的優勢，對生產工藝各階段中TTMP的分析及生成機理研究具有重要意義。