葡萄干總酚最佳提取工藝探究

廉葦佳，雷 靜，韓 琛，陳 雅，吳 斌，阿依加馬麗·加帕爾

（1.新疆農業科學院吐魯番農業科學研究所，新疆吐魯番838000；2.石河子大學食品學院，新疆石河子832003）

葡萄干因其擁有豐富的營養物質和較強的抗氧化能力而廣受歡迎[1-2]，葡萄干的營養成分來源于葡萄，蛋白質、脂肪、碳水化合物和纖維素等營養物質在葡萄干制過程中含量增加，也有一些抗氧化物質被分解或轉化[3]，其中酚類物質是主要的抗氧化物質之一，包括酚酸、黃烷-3-醇、黃酮醇和花青素[4]。新疆吐魯番地區是我國無核白葡萄干的主產區，但由于無核白葡萄干在制干與貯藏過程酚類物質極易被氧化，導致其品質下降，經濟效益降低[5]。目前，對于葡萄干中總酚的提取，提取方法、溶劑、時間、溫度等都有很大不同[6-8]，如Susana Sério[9]等用甲醇∶甲酸=97∶3（v/v）室溫下避光攪拌30 h提取，耗時長且溶劑消耗量大；Antonia Chiou[10]等用甲醇為提取溶劑，1∶20（g∶mL）料液比超聲水浴 15 min，攪拌24 h，離心，收集濾液的方法提取葡萄干中酚類物質，耗時較長，工序復雜；Dongyan Shao[11]等將葡萄干在80%vol乙醇中研磨，超聲30 min，0.22 μm過濾器過濾，測定多酚類物質含量，研磨費時費力且存在誤差。而超聲波輔助溶劑浸提操作簡便、能耗低，可在一定程度上提高提取效率[1]。本研究采用超聲波輔助法提取吐魯番無核白葡萄干中的總酚物質，通過單因素及正交試驗優化提取工藝條件，為進一步開發利用葡萄干資源和優化葡萄干制干工藝提供理論依據與參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料：葡萄干品種為無核白，購于新疆維吾爾自治區吐魯番市高昌區吐魯番葡萄干交易市場，生產日期為2017年9月中旬。

試劑：福林酚試劑(FC顯色劑)，美國Sigma公司；沒食子酸，上海源葉生物科技有限公司；甲醇、無水乙醇、無水碳酸鈉等均為國產分析純試劑。

儀器設備：數控超聲波清洗器（KQ5200DE（40 kHz）型），昆山市超聲儀器有限公司；紫外分光光度計（Specord 50型），德國Analytic Jena公司；電子分析天平（BS214D型），北京賽多利斯儀器系統有限公司；德國Hettich臺式離心機（MIKRO 200R型），德國Hettich科學儀器有限公司；水浴恒溫振蕩器（SHA-C型），金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 葡萄干總酚的提取

稱取一定量葡萄干，加入液氮，用帶不銹鋼杯的打漿機打成粉末，迅速置于-86℃超低溫冰箱中保存[12]。取葡萄干粉末1 g，按不同料液比加入提取溶劑，搖勻，放在超聲波清洗器中于200 W功率條件下進行超聲波輔助提取，提取完成后離心分離，收集上清液，定容后測定提取液中的總酚含量，并按以下公式計算提取率。

式中：c——標曲計算得出的待測液中總酚質量濃度，μg/mL；v——提取液體積，mL；n——稀釋倍數；m——稱取葡萄干粉末質量，g。

1.2.2 提取溶劑及體積分數對葡萄干中總酚提取率的影響

稱取1.000 g葡萄干粉末，選取 20%vol、40%vol、60%vol、80%vol、100%vol乙醇，20%、40%、60%、80%、100%甲醇和蒸餾水為提取溶劑，以1∶10的料液比，在20℃下超聲水浴提取60 min，提取2次后，以4000 r/min離心10 min，定容后測定總酚含量，選取總酚提取率最高的溶劑及體積分數作為提取劑及體積分數。

1.2.3 料液比對葡萄干中總酚提取率的影響

稱取1.000 g葡萄干粉末，選取60%vol乙醇為提取溶劑，分別以1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40 的料液比，在20℃下超聲水浴提取60 min，提取2次后，以4000 r/min離心10 min，定容后測定總酚含量，選取總酚提取率最高的料液比作為提取料液比。

1.2.4 提取溫度對葡萄干中總酚提取率的影響

稱取1.000 g葡萄干粉末，選取60%vol乙醇為提取溶劑，以1∶20的料液比，分別在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃下超聲水浴提取60 min，提取2次后，以4000 r/min離心10 min，定容后測定總酚含量，選取總酚提取率最高的溫度作為提取溫度。

1.2.5 提取時間對葡萄干中總酚提取率的影響

稱取1.000 g葡萄干粉末，選取60%vol乙醇為提取溶劑，以1∶20的料液比，在70℃下超聲水浴提取，提取時間分別為20 min、40 min、60 min、80 min、100 min，提取2次后，以4000 r/min離心10 min，定容后測定總酚含量，選取總酚提取率最高的時間作為提取時間。

1.2.6 提取次數對葡萄干中總酚提取率的影響

稱取1.000 g葡萄干粉末，選取60%vol乙醇為提取溶劑，以1∶20的料液比，在70℃下超聲水浴提取80 min，分別提取1次、2次、3次、4次、5次后，以4000 r/min離心10 min，定容后測定總酚含量，選取總酚提取率最高的次數作為提取次數。

1.2.7 葡萄干中總酚提取工藝正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以乙醇體積分數、料液比、提取溫度、提取時間、提取次數為影響因素，以葡萄干中總酚提取率為響應值，通過5因素4水平正交試驗優化超聲波輔助提取總酚的工藝條件。

1.2.8 葡萄干中總酚含量的測定

參考李靜等[13]的方法略作改動。不同質量濃度的沒食子酸標準品或稀釋后的樣品溶液1.0 mL，依次加入2.5 mL福林酚試劑，混合均勻，50℃下水浴5 min，加入7.5%的碳酸鈉溶液2 mL，顯色30 min后于760 nm波長處測定吸光度，通過沒食子酸標準曲線計算樣品中總酚含量。

2 結果與分析

2.1 提取溶劑及體積分數對葡萄干中總酚提取率的影響（圖1）

葡萄干中總酚的提取溶劑以水、甲醇、乙醇為主，由圖1可知，不同溶劑及體積分數對總酚提取率影響顯著（p＜0.05），乙醇溶液作提取溶劑的提取率最高，其次是甲醇溶液，水溶液作提取溶劑的提取率最低。甲醇溶液及乙醇溶液都有隨著體積分數增大，提取率呈先增大后減小的趨勢，乙醇體積分數為60%vol時，提取率最大，因為水提取模擬了生理條件，水-乙醇體系是普遍經常發生的而且是食物補充劑的成分，所以能夠使酚類物質溶解較多[14]，因而選擇60%vol乙醇作為提取溶劑。

圖1 提取溶劑及體積分數對葡萄干中總酚提取率的影響

2.2 料液比對葡萄干中總酚提取率的影響（圖2）

由圖2可知，不同料液比對葡萄干總酚提取率的影響顯著（p＜0.05）。隨料液比增大，總酚提取率逐漸增大，當料液比為1∶20時，總酚提取率最大，因為增大的料液比有利于葡萄干與提取溶劑充分接觸，從而提高總酚浸出率。料液比達到1∶30時，提取率開始下降，當料液比過大時，總酚溶出量達到飽和，其他雜質溶出增多，反而降低了總酚提取率，過大的料液比使溶劑成本增加，給后續的分離純化帶來不便，因此葡萄干中總酚提取的料液比以1∶20左右比較適宜。

圖2 料液比對葡萄干中總酚提取率的影響

2.3 提取溫度對葡萄干中總酚提取率的影響（圖3）

由圖3可以看出，提取溫度對總酚提取率的影響顯著（p＜0.05）。隨著提取溫度的升高，葡萄干中總酚的提取率也隨之逐漸增大，溫度的提高有利于葡萄皮中多酚類物質的溶出[15]，但同時也加速了多酚類化合物的氧化，導致提取率下降。考慮到多酚類物質的穩定性和節約能源，避免高溫提取對多酚物質的破壞，選擇70℃作為最佳提取溫度。

圖3 提取溫度對葡萄干中總酚提取率的影響

2.4 提取時間對葡萄干中總酚提取率的影響（圖4）

由圖4可知，提取時間對總酚提取率的影響顯著（p＜0.05）。在20～80 min內，葡萄干中總酚提取率隨著超聲時間的延長而增大，但超聲時間超過80 min后，總酚提取率有所下降。在一定時間內，超聲波有利于提取溶劑進入葡萄干中并進行細胞破碎，使得葡萄干中酚類物質溶出。但隨著時間的延長，由于超聲波具有較強的機械剪切作用，長時間作用會使酚類物質分子結構被破壞[16]，多酚物質被氧化，提取率降低，超聲時間延長也可能會使原料中的其他物質溶出，因此選擇超聲時間80 min為宜。

表1 超聲波輔助提取葡萄干中總酚正交試驗因素水平表

圖4 提取時間對葡萄干中總酚提取率的影響

2.5 提取次數對葡萄干中總酚提取率的影響（圖5）

由圖5可以看出，提取次數對葡萄干總酚提取率的影響顯著（p＜0.05）。葡萄干中總酚的1次提取率為0.61%，可基本完全提取出葡萄干中的酚類物質，提取2～5次對提取率的增加效果不顯著，過度增加提取次數不僅會增加生產成本而且還會加大后續工序的處理量，因此，選擇提取次數2～3次為宜。

圖5 提取次數對葡萄干中總酚提取率的影響

2.6 葡萄干中總酚提取工藝正交試驗

為了得到葡萄干中總酚提取最佳工藝條件，綜合上述單因素試驗結果，考察乙醇體積分數、料液比、提取溫度、提取時間和提取次數對葡萄干中總酚提取率的影響，做5因素4水平正交試驗，因素水平表見表1，試驗結果與分析見表2、表3。

表2 超聲波輔助提取葡萄干中總酚正交試驗結果與分析

由正交試驗極差分析和方差分析結果（表2、表3）可以看出，在試驗設計范圍內，5個因素對葡萄干中總酚提取的影響大小依次為料液比（B）＞提取溫度（D）＞乙醇體積分數（A）＞提取時間（C）＞提取次數（E），提取溫度（D）對葡萄干中總黃酮提取有顯著影響（P＜0.05），料液比（B）也對葡萄干中總酚提取有重要作用，但對結果的影響不存在顯著性差異。在試驗設計范圍內，優化得到超聲波輔助提取葡萄干中總酚的最佳提取工藝條件為A2B4C3D2E1，即乙醇體積分數為40%、料液比1∶40、提取時間80 min、提取溫度50℃、提取次數1次。在此條件下進行驗證試驗，葡萄干中總酚的提取率為0.97%。

表3 正交試驗方差分析結果

3 結論

葡萄干中含有重要的抗氧化成分——酚類化合物，應用超聲波輔助提取技術可實現其中總酚物質的快速提取。在200 W超聲功率下，葡萄干中總酚提取的最佳提取工藝條件為：乙醇體積分數40%、料液比 1∶40、提取時間80 min、提取溫度50℃、提取次數1次。在此條件下進行驗證試驗，葡萄干中總酚的提取率為0.97%。