HIV-1衣殼蛋白抑制劑體外篩選方法研究進展

張大為，許曉雙，常 珊

(江蘇理工學院生物信息與醫藥工程研究所，江蘇 常州 213001)

人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)是艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)的病原體[1]。HIV主要有2種亞型：HIV-1和HIV-2，后者具有更高的毒力和傳染性，導致了全球大多數國家的HIV感染[2]。AIDS是全球最為致命的傳染性疾病之一，目前仍無法治愈。30年來，經美國 FDA批準上市的抗HIV-1藥物多達30余種，這些藥物的聯用(亦被稱為高效抗逆轉錄病毒療法)使得艾滋患者的死亡率大幅下降，壽命得到了極大延長，AIDS甚至已經被“馴服”成一種慢性傳染性疾病[3]。然而，由于存在患者依從性差、藥物副作用大和耐藥性病毒株等諸多問題，使得AIDS治療的效果明顯降低[4]。因此，尋找具有優良特點(比如毒副作用小、便于給藥、耐藥基因屏障高)的新一代抗HIV-1藥物顯得非常必要。

1 衣殼蛋白(capsid protein, CA)是理想的抗病毒藥物靶點

HIV-1為逆轉錄病毒，將RNA和重要的病毒蛋白包裹于衣殼中，是該類病毒的重要特征。衣殼由CA組裝而成。近年來，人們逐漸認識到HIV-1衣殼在病毒復制過程中并非是一個“小角色”，而是一個重要的“多面手”[5]：參與病毒的逆轉錄；病毒基因組的核輸入及整合；防止固有免疫效應器的激活。病毒衣殼的組裝和穩定性均會影響HIV-1病毒分子的自我復制和感染性，因此，CA成為潛在的藥物作用靶點。目前，已有研究報道了若干靶向CA的抑制劑，只有Gilead Sciences公司宣布其開發的CA抑制劑 GS-CA1進入了I期臨床試驗[6]。盡管沒有一種CA抑制劑被批準用于臨床，但是這些已經發現的CA抑制劑卻有力地證明了CA是開發抗病毒藥物的有效靶點。此外，與HIV-1病毒的其它蛋白相比，CA蛋白序列相對保守。通過構建單點氨基酸殘基突變庫發現，70%的CA殘基在發生突變后，會導致病毒喪失感染性，CA表現出極度的遺傳脆弱性(genetic fragility)[7]。CA的遺傳脆弱性能在一定程度上降低耐藥性的出現，也提示我們在尋找CA抑制劑的時候，應重點關注CA蛋白遺傳脆弱性最為嚴重的位點。綜上所述，CA是一個理想的藥物作用靶點，發現CA抑制劑具有重要意義。

2 HIV-1衣殼蛋白的結構

HIV衣殼由大約1 500個CA蛋白單體組裝而成。CA源于病毒gag結構基因編碼的前體蛋白，由N端結構域(N-terminal domain，NTD)、C端結構域(C- terminal domain，CTD)和中間的柔性部分組成[8]。NTD由150個氨基酸殘基組成，CTD由70個氨基酸殘基組成，前者主要由α-螺旋、β發卡結構和親環素A結合環組成，后者則包括α-螺旋、310螺旋和保守區域MHR。CA的NTD相互作用，形成環形六聚體(hexamer, HA)和五聚體(pentamer, PA)，HA或PA再通過 CTD之間的相互連接，形成網狀晶格。最終，由大約250個 HA和12個PA組成了圓錐形的“富勒烯”型衣殼[5]。HIV-1衣殼的分解和組裝依賴于CA兩個結構域之間的相互作用[9]。

3 HIV-1的CA抑制劑篩選方法

簡單有效的藥物篩選方法是發現CA抑制劑的前提。目前，已有研究報道了基于不同技術的多種CA抑制劑的篩選方法。本文將對這些篩選方法進行綜述。

3.1非同位素標記非均相篩選法在體外，CA組裝成與真實病毒類似的富勒烯的穩定結構需要苛刻的反應條件：高濃度CA和高離子強度(> 1 mol·L-1NaCl)緩沖液，限制了其直接應用。研究發現，在脫氧寡核苷酸存在下，較低濃度的HIV-1 Gag蛋白就能夠在低離子強度的緩沖液中完成組裝。基于此原理，研究人員設計了一種在體外高通量篩選CA抑制劑的方法：將5′端標記生物素(biotin)的脫氧寡核苷酸d(TG25)固定到中性親和素(neutravidin)包被的黑色384孔板，過夜孵育，洗去未結合的biotin-d(TG25)，加入5′端標記熒光素(fluorescein)的脫氧寡核苷酸d(TG25)和CA-NC蛋白。溶液中的fluorescein-d(TG25)引發CA-NC組裝，之后fluorescein-d(TG25)-CA-NC復合物會結合至biotin-d(TG25)。通過檢測熒光，將實現對CA-NC組裝的檢測。如果CA-NC組裝被小分子抑制，fluorescein-d(TG25)和CA-NC將一同被洗掉，無法檢測到熒光信號，CA-NC的組裝數量與熒光信號呈正相關(Fig 1)[10]。使用該方法，他們發現苯二氮類(benzodiazepines)和苯并咪唑類化合物具有抑制CA組裝的活性。該篩選方法采用生物素-親和素系統，優點是：結合牢固，信號多級放大，操作簡單，可實現高通量篩選。缺點是：親和素包被的微孔板和熒光標記的脫氧寡核苷酸底物，易造成非特異性吸附，需要通過洗板消除背景信號造成的干擾。

3.2同位素標記均相篩選法鄰近閃爍分析(scintillation proximity assay, SPA)是通過檢測放射性同位素衰變中產生的β射線激發閃爍劑發光，實現對分子相互作用檢測的一種技術，被廣泛用于藥物篩選中。有研究發現，在體外，化合物PF-3450074(PF74)能與CA六聚體發生高親和力結合(Kd值為262 nmol·L-1)[11]。為了篩選能夠競爭PF74結合位點的抑制劑，研究人員基于SPA技術，設計了一種高通量的CA抑制劑篩選方法(Fig 2)：先在體外準備好生物素化的CA六聚體(bhCA-1)，然后將bhCA-1、鏈霉親和素包被的SPA微珠和3H同位素標記的PF74([3H]PF74)加入384孔板中孵育。沒有競爭性小分子存在的時候，3H標記的PF74與CA六聚體結合，同位素3H衰變產生的弱β粒子將其能量轉移給SPA微珠表面的閃爍劑，激發閃爍劑發射光子并被檢測器記錄；當沒有競爭性小分子存在時，[3H]PF74將很少甚至不會結合到CA六聚體，3H衰變產生的弱β粒子因距離關系(>1.5 μm)無法將其能量轉移給SPA微珠表面的閃爍劑，檢測信號減弱或者消失[12]。該法的優點是：無需離心、洗滌和過濾等物理過程，靈敏、快速、均相，信號穩定，技術成熟，能用于高通量篩選，篩選得到的化合物結合位點明確。不足之處在于：實驗中產生的同位素污染物需要特殊處理，檢測信號易受小分子自身發色基團的影響而淬滅；SPA微珠表面會因非特異性吸附同位素標記的配體而產生非特異性信號；SPA 技術所用到的材料都非常昂貴，且為少數幾家美國公司所壟斷。

Fig 1 Schematic representation of in vitro capsid assembly assay based on association of CA-NC subunits on immobilized oligonucleotides d (TG25)

Fig 2 Diagram of SPA-based assay strategy[12]

3.3非同位素標記均相篩選法

3.3.1均相時間分辨熒光法(homogeneous time-resolved fluorescence, HTRF) HTRF技術是研究蛋白-蛋白相互作用的常用技術。研究人員基于HTRF設計了一種高通量的CA抑制劑篩選方法(Fig 3)：將GST-CA CTD、CA CTD-Flag、待測化合物、Anti-6His-XL665熒光受體和Anti-GST Cryptate熒光供體一起孵育，在320 nm激光照射下，熒光供體吸收部分能量，產生波長為620 nm的熒光；當 GST-CA 和 CA-Flag形成二聚體時，拉近熒光供體和受體的距離，熒光受體受到轉移過來的能量激發，發射出波長為665 nm的熒光；當有抑制劑存在時，GST-CA 和 CA-Flag不能形成二聚體，熒光受體不被激發，在665 nm處沒有熒光信號產生，只有620 nm處的熒光信號[13]。該高通量篩選的Z因子為0.89，是一個非常理想的抑制劑篩選方法。應用該方法，他們從1 280個化合物中篩選到了1個活性分子依布硒啉(ebselen)。該篩選方法的優點是高通量、無需固相檢測方法中的包被和洗板步驟，因此耗時短、靈敏度高，實時分辨熒光的引入，避免了化合物的自發熒光對實驗的干擾。不足之處是受檢測距離(8～10 nm，相當于60～80 ku的蛋白復合物)限制，無法檢測分子量過大的蛋白-蛋白相互作用復合物。

Fig 3 Schematic representation of HTRF assay [13]

3.3.2放大化學發光接近均相檢測(amplified luminescent proximity homogeneous assay, ALPHA) ALPHA技術主要依賴于經過特殊處理的供體微珠(含光敏劑苯二甲藍)和受體微(含二甲基噻吩、蒽、紅熒烯)。當熒光供體和受體因蛋白-蛋白相互作用，彼此距離小于200 nm時，會引發級聯反應，產生放大的信號，實現對蛋白質-蛋白質相互作用的檢測。研究者利用ALPHA技術建立了一種高通量的CA抑制劑篩選方法(Fig 4)：將GST-CA、CAI-biotin、Streptavidin-微珠(供體)、化合物以及GSH-微珠(受體)加入微孔板孵育，供體在激發光(680 nm激光)照射下產生單線態氧。當GST-CA/AI-biotin形成異二聚體時，會拉近熒光供/受體的距離，使得單線態氧能夠有效的激發熒光受體產生熒光(波長為520～620 nm)，反之，當抑制劑干擾GST-CA和CAI-biotin形成異二聚體，單線態氧因距離原因無法擴散至受體微珠，不能激發后者產生熒光信號[14]。應用該方法，他們從70 000多個小分子中篩選出了具有抑制CA蛋白活性的2-芳基喹唑啉類化合物。該方法的優點是高通量、無需固相檢測方法中的包被和洗板步驟、耗時短、靈敏度高，篩選得到的化合物結合位點相對明確，能克服HTRF對于蛋白復合物尺寸的限制(相互作用復合物在200 nm范圍內均可)。不足之處是設備和試劑成本高，不利于方法的推廣使用。反應體系對于強光或者長時間室內光比較敏感。

Fig 4 Principle of AlphaScreen high-throughput assay based on CAI binding to CA CTD [14]

3.4細胞水平的篩選方法

3.4.1噬菌體展示 噬菌體展示是一項用于篩選多肽或抗體藥物的實驗技術。Sticht等[15]利用噬菌體展示技術建立了一種高通量的CA抑制劑篩選方法：分別將CA蛋白和C-CANC蛋白作為篩選靶蛋白，固定于甲苯磺?；揎椀拇胖楸砻妫捎檬氖删w展示庫篩選。結果篩選到一個能夠抑制CA組裝的12肽CAI (ITFEDLLDYYGP)。該方法的優點價格低廉，不需要特殊儀器設備就能夠實現，不足的地方是操作繁瑣，只能篩選到多肽抑制劑。盡管無法直接篩選到小分子抑制劑，但是從噬菌體多肽庫中篩選到的多肽抑制劑卻為后續設計小分子CA抑制劑提供了良好的理論基礎。

Fig 5 Principle of detection of CA CTD intermolecular interactions using BiFC assay [17]

3.4.3假病毒篩選 HIV-1假病毒篩選體系是一種基于單一復制周期HIV-1假病毒的藥物篩選方法，因安全性高，已被廣泛用于HIV-1的研究中[19]。Lamorte等[20]利用假病毒篩選體系，從600 000個結構類型豐富和復雜的化合物中，篩選到2個結構新穎的化合物BI-1和BI-2。Cao等[21]利用HIV-1假病毒篩選系統，從大于106個化合物中，篩選到1種具有新結構的CA抑制劑PF-1385801，經過結構改造得到了活性較好的候選化合物PF-3450074(PF74)。假病毒篩選方法的優點顯而易見：免于接觸活病毒，無需BSL-3實驗室，安全性高；適合高通量藥物篩選；宿主范圍廣，感染效率高。該技術的局限是：只能用于病毒復制早期階段的抑制劑篩選，無法用于病毒復制晚期的抑制劑篩選；無法全面體現病毒特性，因此在藥物篩選過程中可能更易出現假陽性。

3.5虛擬篩選分子生物學技術、X射線晶體學以及計算方法領域的不斷進步，使得借助計算機技術和專業軟件進行藥物篩選得以實現，這門技術被稱作虛擬篩選。Tang等[22]利用虛擬篩選，以CA的NTD的β-發卡裂口為篩選界面，得到了1個靶向CA CTD的小分子化合物CAP-1，這也是首個CA的小分子抑制劑。Curreli等[23]針對CA CTD中的1個疏水凹槽(由第169～191位氨基酸殘基形成，是CAI 肽結合的 CTD 口袋)，對ZINC化合物庫中100 000個類藥的分子進行了虛擬篩選，從中得到了2個靶向CA CTD的小分子compound 6和compound 50。Kortagere等[24]使用基于藥效團的虛擬篩選方法，結合PDB數據庫中的晶體數據(Protein Databank entry 3H4E)，篩選到了1個靶向CA蛋白N末端(CA NTD)的小分子抑制劑I-XW-053。與傳統實驗篩選相比，虛擬篩選優勢在于高效、快速、經濟，但該方法只能針對具有晶體結構的藥物靶點進行篩選，限制了其在藥物篩選中的應用。

4總結和展望藥物篩選的方法一般可歸為3類：基于表型的藥物篩選、基于靶點的藥物篩選和基于結構的藥物篩選[25]。目前發表的CA抑制劑篩選方法均屬于這3類方法的范疇。在這些方法里面，除了虛擬的篩選方法外，其余方法全部是基于生物化學實驗的篩選體系，未見基于生物物理方法建立的篩選體系。CA蛋白的組裝過程是蛋白-蛋白相互作用不斷發生和穩定的過程，因此，CA蛋白抑制劑實際上就是一類蛋白-蛋白相互作用抑制劑。蛋白-蛋白相互作用作用的界面面積較大(一般在1 000～6 000 ?2之間，傳統的藥物結合口袋面積一般小于1 000 ?2)，通常被認為是無成藥性的靶點。因而，與HIV-1的3個酶(整合酶、蛋白酶和逆轉錄酶)相比，針對CA的小分子抑制劑研究進展相對緩慢。生物物理的方法(比如SPR、ITC、MST、NMR、BLI等)主要被用于分析生物分子之間的相互作用，尤其適用于蛋白-蛋白相互作用的藥物篩選，在未來應該將生物物理的方法用于CA蛋白抑制劑的篩選中，以加快CA蛋白抑制劑的篩選進程。另外，目前藥物篩選庫中的化合物大多符合類藥五規則(rule of five)，這些分子的分子質量一般小于500 u，難以實現阻斷蛋白-蛋白相互作用的任務。因此，在尋找CA抑制劑的過程中，必須打破類藥五規則，突破常規，才能更快地尋找到相應的抑制劑 。綜上所述，藥物篩選是一項系統工程，選擇具有蛋白-蛋白抑制劑特點的小分子，將實驗篩選(包括生物化學和生物物理的方法)和虛擬篩選相結合，將是今后CA抑制劑篩選的方向，有望篩選出用于臨床的CA抑制劑。