電離輻照損傷對小鼠睪丸組織氧化磷酸化信號通路的影響

羅芳芳，李 敏，易輝燕,，吳莎莎，唐 莉，王繼生

[1. 西南醫(yī)科大學藥學院，四川 瀘州 646000；2. 綿陽市第三人民醫(yī)院(四川省精神衛(wèi)生中心)，四川 綿陽 621000]

電離輻射主要由X、γ射線電磁波或α、β粒子組成[1]。電離輻射致機體損傷主要是通過細胞凋亡、微循環(huán)障礙、DNA突變、癌變等途徑，對人體的免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、造血功能及代謝系統(tǒng)造成影響[2-3]。隨著社會發(fā)展，人們在生活中常接觸到電離輻射，如醫(yī)療輻射、電器輻射等，輻射損傷受到人們廣泛關(guān)注，它已成為威脅人類健康的重要因素，尤其是近年來男性生殖功能下降和不育癥發(fā)病率逐步增多，輻射對男性生殖系統(tǒng)的影響日益被重視。

睪丸作為男性重要的生殖器官，主要產(chǎn)生精子和分泌雄激素，它在男性生育功能的研究中至關(guān)重要[4]。睪丸對電磁輻射具有高度敏感性，可引起生精細胞超微結(jié)構(gòu)損傷[5]。抗氧化酶活性下降，脂質(zhì)過氧化增加，炎性因子的過度表達和基因轉(zhuǎn)錄異常可能是睪丸組織受損的重要原因[6]。輻射誘導的雄性生殖細胞毒性，可造成機體出現(xiàn)生育力下降，甚至不育[7]。研究輻射損傷機制有重要的意義，既研究發(fā)現(xiàn)電離輻射影響線粒體生理學多方面的報道，包括線粒體呼吸、ATP產(chǎn)生和線粒體動力學[8-9]。線粒體也被認為參與輻射誘導的細胞內(nèi)和細胞間信號傳導[10]。這些發(fā)現(xiàn)表明線粒體可能是電離輻射的重要靶標，在細胞放射應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。近年來，隨著研究技術(shù)發(fā)展，人們開始利用蛋白質(zhì)組學、相對和絕對定量(iTRAQ)、LC-MS/MS等技術(shù)手段，來研究輻射組織的差異表達蛋白、生殖細胞DNA損傷、信號通路等數(shù)據(jù)，從而尋找有價值的研究方向。本實驗采取iTRAQ聯(lián)合LC-MS/MS檢測技術(shù)及生物信息學數(shù)據(jù)分析，提取出輻照組(ioning radiation，IR)與正常組小鼠睪丸組織比較后的差異表達蛋白質(zhì)。運用David 6.8對差異蛋白進行KEGG富集分析，鑒定出生物信號通路，進一步篩選出氧化磷酸化這一信號通路進行詳細分析。本實驗為研究小鼠睪丸組織電離輻照后能量代謝損傷機制提供理論基礎(chǔ)和備選分子靶標。

1 材料

1.1實驗動物清潔級昆明種♂小鼠20只，體質(zhì)量(20±2)g，購自第三軍醫(yī)大學實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK(軍)2012-0011。將實驗小鼠在晝夜比為1 ∶1的環(huán)境下循環(huán)飼養(yǎng)，實驗室保持室內(nèi)溫度(22～26) ℃，濕度44%～65%。給予所有小鼠正常飲食、飲水，飼養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境。該實驗已經(jīng)通過綿陽市第三人民醫(yī)院倫理會審核通過，均遵守實驗動物照料和使用原則。

1.2試劑與儀器iTRAQ標記試劑盒(美國ABSCIEX公司)；胰酶(美國Promega公司)。LC-6AD型高效液相色譜儀(日本島津)；TRIPLE TOF5600質(zhì)譜儀配套軟件(美國ABSCIEX公司)；RVC 2-33 IR型真空離心濃縮儀(德國Christ)；SPD2010型SpeedVac真空離心器(美國Thermo Savant)。

2 方法

2.1動物分組將實驗小鼠隨機分為空白組和IR組，每組10只。輻照前，每天給予所有小鼠正常飲水、飲食。

2.2建立電離輻照損傷模型IR組小鼠常規(guī)飼養(yǎng)7 d后，將小鼠置于自制的紙盒內(nèi)，給予1次60Co γ射線全身輻照。輻照條件為[11]：5 Gy，輻照率為1.73 Gy· min-1。照射后，繼續(xù)給予IR組和空白組小鼠正常飲水、飲食。

2.3標本收集在輻照完成7 d后，用3.5%水合氯醛麻醉小鼠，在無菌條件下解剖，切開小鼠陰囊暴露雙側(cè)睪丸，取出睪丸組織，經(jīng)蘇木精-伊紅染色，確認模型成功后，將其余小鼠睪丸組織用0.9%滅菌生理鹽水反復清洗后，放置于液氮速凍，-80 ℃冰箱保存。

2.4睪丸組織蛋白質(zhì)的提取在裂解緩沖液中加入1 μL蛋白酶抑制劑、5 μL磷酸酶抑制劑和10 μL PMSF至混合均勻后，分裝于2支冰上預冷玻璃勻漿器中。取凍存的小鼠睪丸組織，每組3只，PBS清洗，按組別放入玻璃勻漿器中，加預冷的裂解緩沖液裂解，手動充分研磨，至均質(zhì)勻漿。冰上超聲破碎，功率為80 W，超聲0.8 s，關(guān)閉0.8 s，共3 min。加入5倍體積預冷丙酮混勻，靜置于-20 ℃環(huán)境沉淀4 h，8000 r·min-1、4 ℃離心5 min，棄上清液，取沉淀，反復操作，至沉淀變?yōu)榘咨?/p>

2.5蛋白定量、還原烷基化及酶切、標記、強陽離子交換器(strongcationexchanger，SCX)分級采用Bradford法測定實驗樣品的蛋白質(zhì)濃度，利用二硫蘇糖醇打開二硫鍵及碘代乙酰胺烷基化二硫鍵，使蛋白質(zhì)充分變性。iTRAQ試劑平衡到室溫后，緊接著離心至管底，再取150 μL異丙醇至iTRAQ試劑中溶解，取上述的酶解產(chǎn)物50 μL至新的離心管中，再加入iTRAQ試劑，在室溫反應(yīng)2 h，加入水，使有機相降低至50%以下終止反應(yīng)，混合、渦旋振蕩、離心后真空冷凍干燥。各組蛋白進行標記。將標記多肽混合物用流動相A(150 μL)經(jīng)復溶、渦旋振蕩處理后，12 000 r·min-1離心20 min，吸取上清液上樣，流速0.8 mL·min-1，按不同的參數(shù)梯度洗脫，根據(jù)峰形和時間收集共收50個梯度，冷凍抽干后保存待用。

2.6質(zhì)譜鑒定各組樣品用Q-TOF(質(zhì)譜TOF MS參數(shù)m/z：350～1500；積累時間：0.25 s)進行iTRAQ 標記樣品的質(zhì)譜信息的檢測，獲得iTRAQ 標記肽段的序列，再根據(jù)肽指紋圖譜鑒定出相應(yīng)蛋白質(zhì)。兩iTRAQ離子的峰面積比值可以反映樣品中多肽和蛋白質(zhì)的相對含量。

2.7統(tǒng)計學處理所有實驗數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS 22.0軟件進行分析，數(shù)據(jù)方差齊性采用參數(shù)檢驗和非參數(shù)檢驗，方差齊則采用One-way ANOVA分析，兩兩比較用LSD檢驗；方差不齊則采用秩和檢驗。

3 結(jié)果

3.1HE染色Fig 1的HE染色結(jié)果可見，正常組睪丸組織曲細精管結(jié)構(gòu)完整，生殖上皮基膜完整，曲細精管管腔內(nèi)可見各級細胞精母細胞發(fā)育正常，由外到內(nèi)排列緊密整齊，層次清晰分明。精子數(shù)量多，無炎細胞，凋亡罕見。輻射組與正常組相比較，可見生精小管排列有紊亂疏松，管腔內(nèi)精子量減少，凋亡細胞數(shù)量增加。

Fig 1 Testicular Tissues in normal group and IR group (HE×400)

3.2蛋白質(zhì)鑒定經(jīng)重慶醫(yī)科大學生命科學院iTRAQ技術(shù)平臺進行蛋白質(zhì)組學測定，3次技術(shù)重復所鑒定到蛋白質(zhì)的維恩分析結(jié)果見Fig 2。本實驗共鑒定出蛋白質(zhì)1 633個，包含差異蛋白128個，其中28個表達上調(diào)，100個表達下調(diào)。

Fig 2 Differential protein Venn diagram between ionzing radiation group and normal group

A: Represents 2 768 proteins identified in the first assay; B: Represents 2 957 proteins identified in the second assay; C: Represents 3 306 proteins identified in the third assay.

3.3KEGG通路注釋結(jié)果將IR組和空白組小鼠睪丸組織鑒定到的差異蛋白，運用David 6.8進行KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)共有57個差異表達蛋白質(zhì)，參與了21條生物信號通路(P<0.05)，其中表達上調(diào)的蛋白質(zhì)有13個，表達下調(diào)的有44個。差異蛋白富集明顯的10條信號通路結(jié)果見Fig 3。從圖中可以看出，差異蛋白主要富集在與帕金森病、亨廷頓氏病、氧化磷酸化、阿爾茨海默病、抗生素生物合成、代謝途徑等相關(guān)的信號通路中。

Fig 3 Differential protein KEGG pathway analysis of testis tissues between IR group and blank group (top 10)

1:Parkinson’s disease; 2:Huntington’s disease; 3:Oxidative phosphorylation; 4:Alzheimer’s disease; 5:Non-alcoholic fatty liver disease(NAFLD); 6:Glycolysis ;7:Biosynthesis of antibiotics;8:Metabolic pathways;9:Pyruvate metabolism;10:Cardiac muscle contraction

本實驗發(fā)現(xiàn)富集于氧化磷酸化信號通路中的差異蛋白有13個，分別是線粒體ATP合成酶α亞基(mitochondrial ATP synthase subunit alpha，Atp5a1)、線粒體ATP合成酶β亞基(Atp5b)、線粒體細胞色素b-c1復合物6亞基(mitochondrial cytochrome b-c1 complex subunit 6，Uqcrh6)、細胞色素b-c1復合物8亞基(Uqcrq8)、細胞色素C氧化酶亞基(cytochrome C oxidase subunit，Cox6b2)、線粒體細胞色素C氧化酶5a亞基(Cox5a，)、細胞色素C氧化酶6c亞基(Cox6c)、細胞色素C氧化酶IV亞基1亞型(cytochrome C oxidase subunit IV isoform 1，Cox4i1)、NADH脫氫酶[輔酶Q]1α亞基8(Ndufa8)、線粒體NADH脫氫酶[輔酶Q]1α亞基9(Ndufa9)、線粒體NADH脫氫酶[輔酶Q]鐵硫蛋白2(mitochondrial NADH dehydrogenase [ubiquinone] iron-sulfur protein 2，Ndufs2)、線粒體NADH脫氫酶[輔酶Q]鐵硫蛋白3(Ndufs3)、NADH脫氫酶[輔酶Q]鐵硫蛋白5(Ndufs5)，它們均為表達下調(diào)，信號通路圖見Fig 4，其中表達明顯下調(diào)的蛋白Ndufs5的肽段鑒定的質(zhì)譜圖見Fig 5。通過查詢Uniport數(shù)據(jù)庫的蛋白質(zhì)信息，對13個差異蛋白的生物學過程、分子功能、細胞成分進行整理分析，發(fā)現(xiàn)它們參與了線粒體電子傳遞、線粒體呼吸鏈復合物I裝配、ATP生物合成等過程，其中Cox4i1主要分布于膜，Cox6b2和Ndufa9主要分布于線粒體，其余10個差異蛋白主要分布于膜、線粒體、線粒體內(nèi)膜。進一步利用String10.5和Cytoscape 3.6.1制作差異蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖見Fig 6，發(fā)現(xiàn)這些蛋白之間是相互聯(lián)系的。其中，Cox4i1、Cox5a分別與其它12個蛋白質(zhì)之間都有緊密聯(lián)系，它們在該信號通路中發(fā)揮著重要作用。

Fig 4 Difference between IR group and blank group in oxidative phosphorylation signaling pathway The red asterisk indicates the location of the enriched differential proteins in this pathway.

Fig 6 Interaction network diagrams of 13 differential proteins’ oxidative phosphorylation signaling pathway between IR group and blank group

4 討論

新陳代謝是動物生命活動的基本特征，生物體內(nèi)物質(zhì)代謝過程中所伴隨的能量釋放、轉(zhuǎn)移和利用等，稱為能量代謝。它受到肌肉活動、精神活動、食物和環(huán)境溫度等因素影響。以往的研究數(shù)據(jù)顯示，輻射對于動物腦部、心臟和生精細胞具有明顯的損傷作用，能夠引起能量代謝異常，誘發(fā)心肌細胞凋亡[12]、神經(jīng)細胞信號轉(zhuǎn)導通路異常和生精細胞損傷[13]，這些對于現(xiàn)在研究電離輻射對機體損傷的作用機制有重要意義。

氧化磷酸化是指在生物氧化過程中，伴隨著ATP生成的作用。分為代謝物連接的磷酸化和呼吸鏈連接的磷酸化兩種類型：另一種是底物水平磷酸化；一種是在呼吸鏈電子傳遞過程中偶聯(lián)ATP的生成，生物體內(nèi)95%的ATP來源于這種方式。線粒體為細胞的生命活動提供能量。1961年，英國學者提出的化學滲透假說，說明電子傳遞釋放出的能量可用于形成一種跨線粒體內(nèi)膜的質(zhì)子梯度(H+梯度)，驅(qū)動ATP合成。這一過程主要由線粒體內(nèi)膜上的NADPH-泛醌、泛醌-Cytc還原酶、琥珀酸-泛醌還原酶、細胞色素C氧化酶和ATP合成酶組成的呼吸鏈酶完成[14]。

NADH脫氫酶(又稱為NADH脫氫酶復合物、NADH:輔酶Q還原酶或復合體Ⅰ)是一種位于線粒體內(nèi)膜，催化電子從NADH傳遞給輔酶Q的酶，它是線粒體中氧化磷酸化的“入口酶”，是線粒體電子傳遞鏈中的第1個酶(復合體I)。該實驗氧化磷酸化信號通路所涉及的差異蛋白中，有5個都屬于NADH脫氫酶[泛醌]類，其中Ndufa8、Ndufs2、Ndufs3、Ndufs5主要分布于膜、線粒體、線粒體內(nèi)膜，Ndufa9主要分布于線粒體中。Ndufa8、Ndufa9、Ndufs5參與線粒體呼吸鏈復合物I裝配，但不參與催化作用。Ndufs2、Ndufs3是參與線粒體膜呼吸鏈的核心亞單位，被認為屬于催化所需的最小組裝體。在被輻射的小鼠睪丸組織中，這些蛋白表達下調(diào)，將影響電子在線粒體呼吸鏈中的正常傳遞，從而影響睪丸組織生理功能。

細胞色素是一類以血紅素作為輔基的電子傳遞蛋白，主要參與動物體內(nèi)的氧化還原反應(yīng)。根據(jù)不同的輔基結(jié)構(gòu),可分為a、b、c和d類，它們在細胞能量轉(zhuǎn)移中起著極為重要的作用。哺乳動物細胞色素C氧化酶是線粒體呼吸鏈的末端酶，催化電子從細胞色素C向氧的轉(zhuǎn)移。它是一種復合酶，包含3個執(zhí)行催化功能的線粒體DNA編碼亞基和10個調(diào)節(jié)催化活性的核編碼亞基。細胞色素C氧化酶活性控制線粒體呼吸鏈的電子傳遞能力，從而控制線粒體偶聯(lián)的效率，進而控制活性氧的產(chǎn)生。本實驗氧化磷酸化信號通路所涉及的差異蛋白屬于細胞色素C氧化酶亞基和細胞色素bc1復合物亞基，其中Uqcrh和Uqcrq是泛醌細胞色素C還原酶復合體的組成成分，是線粒體呼吸鏈的組成部分。Cox5a、Cox6c是線粒體電子傳遞鏈中的末端氧化酶。它們的表達下調(diào)，導致細胞中能量轉(zhuǎn)移不能正常進行，從而影響輻射后小鼠睪丸組織中的能量代謝。

動物中，ATP合成酶廣泛分布于線粒體內(nèi)膜的質(zhì)膜上，在跨膜質(zhì)子動力勢的推動下，參與呼吸鏈氧化磷酸化。ATP合成酶分子結(jié)構(gòu)由F1和Fo部組成[15]。F1在膜的外側(cè)，由5個不同的亞基組成，F(xiàn)0是由3個亞基構(gòu)成。ATP合成過程中，F(xiàn)1F0-型ATP合成酶是細胞能量交換的一個關(guān)鍵酶。這個大分子蛋白復合體利用電子梯度和相關(guān)的膜電勢來合成ATP，它也可以逆過程并且水解ATP產(chǎn)生電子梯度，他們必須相互聯(lián)系，并且互換能量。本實驗氧化磷酸化信號通路所涉及的差異蛋白為Atp5a1和Atp5b，屬于F1部分，F(xiàn)1在膜的外側(cè)，它的表達下調(diào)，導致關(guān)鍵酶ATP合成酶不能正常發(fā)揮應(yīng)有的功能，細胞不能正常交換能量，這是小鼠睪丸組織在核輻射后組織損傷的重要機制。

本實驗氧化磷酸化信號通路中所涉及的NADH脫氫酶、細胞色素bc1復合體、細胞色素氧化酶、ATP合成酶這幾種酶的亞基，共同參與了ATP的合成過程。該信號通路中的13個差異蛋白在小鼠接受電離輻照后的睪丸組織中均出現(xiàn)低表達，使線粒體呼吸鏈受損，影響ATP的合成和能量供應(yīng)，繼而影響睪丸組織的正常生理功能。以上結(jié)果揭示氧化磷酸化對機體ATP的合成至關(guān)重要，因此，通過對氧化磷酸化通路的深入研究，將有助于進一步了解電離輻照后睪丸組織能量代謝障礙的機制，也為電離輻照損傷的臨床研究尋找新靶點提供理論依據(jù)。

(致謝：感謝中國工程物理研究院核物理與化學研究所對動物造模提供幫助，感謝綿陽市第三人民醫(yī)院病理科的宋大萍老師給予病理技術(shù)支持與指導，感謝王蕾、徐敬文、王小紅、唐文誠、吳思霖在動物實驗中給予支持與幫助。)