黃芪甲苷調(diào)控自噬抑制缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖HT22細(xì)胞凋亡

張 怡，靳曉飛，周曉紅，董賢慧，張 穎，于文濤，高維娟

(河北中醫(yī)學(xué)院河北省中醫(yī)藥防治心腦血管病基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050091)

缺血性腦卒中是臨床常見病和多發(fā)病，其治療基礎(chǔ)主要為梗死組織周邊缺血半暗帶的血流恢復(fù)，但有時(shí)缺血區(qū)血流恢復(fù)后導(dǎo)致的再灌注損傷會(huì)造成更為嚴(yán)重的腦損傷[1-2]。細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬是影響腦缺血/再灌注損傷(cerebral ischemia- reperfusion injury，CIRI)發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，在腦缺血發(fā)生后，激活細(xì)胞自噬可抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，從而減輕腦組織損傷[3]。中藥黃芪味甘，性微溫，廣泛應(yīng)用于氣虛血瘀型腦血管病的臨床治療[4]。黃芪甲苷是黃芪的主要活性成分之一，本課題組前期研究證實(shí)，黃芪甲苷可有效抑制缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖(oxygen and glucose deprivation/reoxygenation, OGD/R)PC12細(xì)胞凋亡，但黃芪甲苷能否通過調(diào)控自噬，發(fā)揮其對(duì)OGD/R神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用，少有報(bào)道。因此，本研究采用HT22細(xì)胞為研究對(duì)象，通過OGD/R模擬CIRI過程，探討黃芪甲苷是否通過調(diào)控自噬，抑制HT22細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料

1.1細(xì)胞株小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系HT22，由河北醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心許順江教授惠贈(zèng)。

1.2試劑黃芪甲苷(純度>98 %)，購于上海源葉生物科技有限公司；胎牛血清，購自浙江天杭生物科技股份有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、DMEM無糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶，均購于美國Gibco公司；青鏈霉素混合液，購自BIOND公司；Triton X-100、多聚賴氨酸，均購自北京索萊寶科技有限公司；Bcl-2單克隆抗體購自abcam公司；Bax多克隆抗體、Alexa Fluor488標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、Cy3標(biāo)記驢抗兔IgG、DAPI染液均購自武漢谷歌生物科技有限公司；CCK-8試劑盒，購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase， LDH)檢測試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)、雷帕霉素(rapamycin，Rapa)，購于美國Sigma公司。

1.3儀器3111型CO2培養(yǎng)箱、3131型三氣培養(yǎng)箱、Varioskan LUX型多功能微孔板讀數(shù)儀(Thermo公司)；超凈工作臺(tái)SW-CJ-ID型(蘇州凈化公司)；DMI3000B型倒置顯微鏡、DM5000B型熒光顯微鏡(Leica公司)。

2 方法

2.1HT22細(xì)胞的培養(yǎng)HT22細(xì)胞接種于含10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞復(fù)蘇后，培養(yǎng)1～2代進(jìn)行OGD/R模型建立。

2.2HT22細(xì)胞OGD/R模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組取對(duì)數(shù)生長期的 HT22細(xì)胞，隨機(jī)分為8組：正常對(duì)照組(Control)、模型組(Model)、溶劑對(duì)照組(DMSO)、黃芪甲苷組(AS-IV)、黃芪甲苷組加正常細(xì)胞組(AS-IV+N)、黃芪甲苷加自噬抑制劑組(AS-IV+3-MA)、自噬抑制劑組(3-MA)、自噬激活劑組(Rapa)。除正常對(duì)照組及黃芪甲苷組加正常細(xì)胞組外，其余各組均缺氧缺糖6 h后復(fù)氧復(fù)糖，建立OGD/R細(xì)胞模型：HT22細(xì)胞棄去正常細(xì)胞培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液的DMEM高糖培養(yǎng)基)，用預(yù)熱的PBS清洗2遍后，更換培養(yǎng)液為DMEM無糖培養(yǎng)基以模擬細(xì)胞缺血狀態(tài)，然后放入含94% N2+5% CO2+1% O2的37 ℃三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，氧糖剝奪6 h后，將DMEM無糖培養(yǎng)基更換為正常細(xì)胞培養(yǎng)液，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。各給藥組于復(fù)氧復(fù)糖的同時(shí)分別給予含黃芪甲苷(終濃度為100 μmol·L-1)、自噬抑制劑3-MA(終濃度為5 mmol·L-1)、黃芪甲苷+3-MA和自噬激活劑Rapa(終濃度為250 nmol·L-1)的不同細(xì)胞培養(yǎng)液，溶劑對(duì)照組給予含等體積的DMSO細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后觀察各組細(xì)胞形態(tài)，并進(jìn)行指標(biāo)檢測。

2.3CCK-8法檢測細(xì)胞存活率各組細(xì)胞于OGD/R 24 h后，分別于96孔板中每孔加入10 μL CCK-8溶液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育45 min后，在多功能微孔板讀數(shù)儀中測定OD450 nm值，檢測細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)×100%。

2.4LDH漏出率檢測在96孔板中加入細(xì)胞上清液及LDH試劑，混勻，室溫靜置5 min后，在多功能微孔板讀數(shù)儀中測OD450值，此為細(xì)胞上清中LDH釋放量。向原含細(xì)胞的培養(yǎng)板中加入1% Tritonx-100，室溫反應(yīng)20 min后，取細(xì)胞反應(yīng)液及LDH試劑混勻，室溫靜置5 min，450 nm測定吸光值為細(xì)胞破膜液LDH釋放量。LDH漏出率=上清LDH /(上清LDH+細(xì)胞破膜液LDH )×100%。

2.5免疫熒光檢測Bax、Bcl-2將蓋玻片用多聚賴氨酸包被，細(xì)胞種植于包被好的玻片上，制備細(xì)胞爬片，然后進(jìn)行造模及給藥處理。細(xì)胞爬片用4%多聚甲醛固定20 min；1% Triton X-100破膜15 min；BSA室溫孵育30 min；甩掉封閉液后，先后滴加配好的Bax(1 ∶100)和Bcl-2(1 ∶100)，4 ℃孵育過夜；PBS洗去一抗后，滴加相應(yīng)二抗，避光室溫孵育50 min；PBS洗去二抗后，滴加DAPI染液，避光室溫孵育10 min；封片；每張細(xì)胞爬片隨機(jī)選取3個(gè)視野進(jìn)行拍照，采用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行分析。

3 結(jié)果

3.1OGD/R模型HT22細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化如Fig 1所示，正常組細(xì)胞表現(xiàn)為貼壁生長，細(xì)胞呈兩極或多極，突觸明顯，突觸之間相互交織成網(wǎng)狀，細(xì)胞膜光滑、完整，胞體折光性強(qiáng)；與正常組相比，模型組和DMSO組細(xì)胞胞體突觸明顯減少，細(xì)胞皺縮、變圓，胞質(zhì)凝聚，細(xì)胞間連接大量減少，細(xì)胞貼壁不緊，部分細(xì)胞團(tuán)脫落，胞體折光性下降；與模型組比較，AS-IV組上述表現(xiàn)有所緩解。

Fig 1 Morphological observation under optical microscope in each group (scale bar=50 μm)

A: Control; B: Model; C: DMSO; D: AS-IV. Arrow indication: A: Normal cells; B, C: Damaged cells after OGD/R; D; Damage-relieving cells after Astragaloside IV treatment.

3.2黃芪甲苷明顯提高OGD/R的HT22細(xì)胞存活率如Fig 2所示，與正常組相比，模型組細(xì)胞存活率明顯下降(P<0.01)，AS-IV+N組無差別；與模型組比較，AS-IV組細(xì)胞存活率明顯升高(P<0.01)，DMSO組細(xì)胞存活率無差別。

3.3黃芪甲苷通過調(diào)控自噬提高OGD/R的HT22細(xì)胞存活率如Fig 3所示，與正常組相比，模型組細(xì)胞存活率明顯下降(P<0.01)；與模型組比較，AS-IV、Rapa組細(xì)胞存活率明顯升高(P<0.01)，3-MA組細(xì)胞存活率明顯下降(P<0.01)，AS-IV+3-MA 組細(xì)胞存活率無差別；與AS-IV組比較，AS-IV+3-MA組、3-MA組細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.01)。

Fig 2 Cell viability of HT22 cells treated by astragaloside IV after OGD/R n=6)

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group

Fig 3 Cell viability of HT22 cells under different

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group;▲▲P<0.01vsAS-IVgroup

3.4黃芪甲苷明顯降低OGD/R的HT22細(xì)胞LDH漏出率如Fig 4所示，與正常組相比，模型組LDH漏出率明顯升高(P<0.01)，AS-IV+N組無差別；與模型組比較，AS-IV組LDH漏出率明顯降低(P<0.01)，DMSO組無差別。

3.5黃芪甲苷通過調(diào)控自噬降低OGD/R的HT22細(xì)胞LDH漏出率如Fig 5所示，與正常組相比，模型組細(xì)胞LDH漏出率明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，AS-IV、Rapa組細(xì)胞LDH漏出率明顯降低(P<0.01)，3-MA組、AS-IV+3-MA 組無差別；與AS-IV組比較，AS-IV+3-MA組、3-MA組細(xì)胞LDH漏出率明顯升高(P<0.01)。與細(xì)胞存活率檢測趨勢基本一致。

3.6OGD/R的HT22細(xì)胞中Bcl-2、Bax的表達(dá)Fig 6的免疫熒光檢測結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組細(xì)胞Bax/Bcl-2明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，AS-IV、Rapa組細(xì)胞Bax/Bcl-2明顯降低(P<0.05)，3-MA組細(xì)胞Bax/Bcl-2明顯升高(P<0.01)，AS-IV+3-MA組無差異；與AS-IV組比較，3-MA組、AS-IV+3-MA組細(xì)胞Bax/Bcl-2明顯升高(P<0.01)。

Fig 4 LDH level of HT22 cells treated by astragaloside IV after OGD/R

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group

Fig 5 LDH level of HT22 cells under different treatment after n=6)

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group;▲▲P<0.01vsAS-IV group

4 討論

關(guān)于缺血性腦卒中的治療，恢復(fù)缺血區(qū)的血流供應(yīng)是避免腦組織缺血損傷的首要條件，但隨之帶來的再灌注損傷也日益受到醫(yī)學(xué)界的重視。CIRI的發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，涉及細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬等多種病理生理過程。諸多研究證實(shí)，細(xì)胞凋亡是CIRI繼發(fā)性損傷發(fā)生的重要機(jī)制[5]。Bax和Bcl-2是調(diào)控凋亡的重要蛋白，兩者的比值是決定凋亡發(fā)生與否的重要因素[6]。CIRI后，大量活性氧、自由基等所引起的氧化應(yīng)激等因素，也會(huì)引發(fā)自噬的發(fā)生[7]。研究發(fā)現(xiàn)，CIRI后自噬被適度激活能夠明顯縮小CIRI后梗死容積，減少神經(jīng)元死亡，減輕神經(jīng)功能障礙，從而減輕缺血/再灌注損傷[8-9]。凋亡和自噬作為細(xì)胞自我銷毀的兩種主要機(jī)制，兩者之間存在著密切關(guān)系。自噬可通過清除受損細(xì)胞器或蛋白，為細(xì)胞重新供能，使細(xì)胞免于凋亡，對(duì)CIRI的預(yù)后發(fā)揮著重要作用[10]。

A: Immunofluorescence of Bax and Bcl-2; B:Ratio of Bax and Bcl-2.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group,▲▲P<0.01vsAS-IV group

中藥黃芪為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的根，臨床上用于治療脾胃虛弱、表虛自汗、膿毒潰瘍、半身不遂等，具有補(bǔ)氣健脾、固表斂汗、化瘀消腫、生肌斂瘡的功效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，黃芪具有擴(kuò)張血管、改善腦血流量、降低血液黏度、增加微循環(huán)灌注等作用，為治療缺血性卒中的常用藥[11-12]。黃芪甲苷為黃芪主要活性成分，具有清除氧自由基、抗炎、抗病毒、抗衰老、抗血小板凝集等生物活性，可通過抑制細(xì)胞凋亡、改善能量代謝等途徑，抑制腦缺血/再灌注損傷[13-14]。

本研究以常用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究的HT22細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過OGD/R模擬CIRI過程。OGD/R后給予黃芪甲苷處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃芪甲苷能夠有效提高OGD/R HT22細(xì)胞的存活率、降低LDH漏出率，對(duì)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞給予黃芪甲苷處理后證實(shí)，黃芪甲苷對(duì)正常細(xì)胞無影響。基于上述結(jié)果，進(jìn)一步探索黃芪甲苷發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制。HT22細(xì)胞經(jīng)OGD/R處理后，分別給予黃芪甲苷、黃芪甲苷+自噬抑制劑、自噬抑制劑和自噬激活劑處理。結(jié)果顯示，黃芪甲苷和自噬激活劑均能明顯提高OGD/R HT22細(xì)胞存活率，降低LDH漏出率及Bax/Bcl-2值，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，但黃芪甲苷治療效果優(yōu)于自噬激活劑；而同時(shí)給予黃芪甲苷和自噬抑制劑處理后，黃芪甲苷的保護(hù)作用被阻斷；單獨(dú)給予自噬抑制劑后，HT22細(xì)胞存活率較模型組明顯降低，LDH漏出率及Bax/Bcl-2明顯升高，細(xì)胞損傷加重。證實(shí)激活自噬對(duì)OGD/R HT22細(xì)胞具有保護(hù)作用，抑制自噬則導(dǎo)致?lián)p傷加重。因此，本研究認(rèn)為黃芪甲苷對(duì)OGD/R HT22 細(xì)胞具有神經(jīng)保護(hù)作用，且這種保護(hù)作用可能是通過激活自噬，抑制細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。