紅景天苷對(duì)CoCl2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞低氧損傷的神經(jīng)保護(hù)作用

楊澤霖，洪桂祝，張小琴，南麗紅，黃 鑫，林 昱，唐宇恒，劉俊杰，汪旭雯，賴文芳，褚克丹

(福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122)

景天科植物紅景天(RhodiolaroseaL.)是我國(guó)歷史悠久的傳統(tǒng)中藥，具有益氣活血、治療胸痹心痛、中風(fēng)偏癱等功效。紅景天苷是中藥紅景天的主要有效成分。課題組前期研究表明，紅景天苷對(duì)大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型具有神經(jīng)保護(hù)作用[1-4]。在現(xiàn)階段的研究中，在炎癥反應(yīng)中起重要作用的補(bǔ)體系統(tǒng)日益受到重視，受到過度激活的補(bǔ)體系統(tǒng)所產(chǎn)生的炎癥效應(yīng)片段，是造成腦內(nèi)炎癥反應(yīng)損傷的主要始動(dòng)因素之一[5]。來(lái)源于鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤的PC12細(xì)胞具有神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)特征與功能，被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究。CoCl2是一種常用的化學(xué)性低氧模擬劑，在多種細(xì)胞中能誘導(dǎo)低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor，HIF)的表達(dá)，模擬缺氧狀況，引起細(xì)胞缺氧、凋亡等相關(guān)反應(yīng)[6]。本文主要研究紅景天苷對(duì)化學(xué)低氧損傷PC12細(xì)胞中C3、Egr1、Egr4表達(dá)的影響，觀察紅景天苷是否能夠逆轉(zhuǎn)PC12細(xì)胞的神經(jīng)損傷，探討紅景天苷神經(jīng)保護(hù)作用的分子機(jī)制。

1 材料

1.1細(xì)胞株P(guān)C12細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。

1.2藥品與試劑紅景天苷由福建中醫(yī)藥大學(xué)提供，純度≥98%；胎牛血清(HyClone，貨號(hào)：SV 30087.02)；Egr1(588)抗體(貨號(hào)：sc-110)、Egr4(U-25)抗體(貨號(hào)：sc-133540)、C3a受體拮抗劑(C3a receptor antagonist，C3aRA)(貨號(hào)：SC-222291)，均購(gòu)自Santa Cruz公司；β-actin 抗體(碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：AA128)；Egr4 siRNA(Qiagen，貨號(hào)：SI01509025)；caspase-3 活性檢測(cè)試劑盒(Cell Signaling Technology，貨號(hào)：#5732S)；DeadEndTMFluorometric TUNEL System(美國(guó)Promega公司，貨號(hào)：G3250)；RNeasy? Mini Kit(QIAGEN，貨號(hào)：74104、74106)；RevertaidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas，貨號(hào)：K1622)；TaqMan?Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems，貨號(hào)：R11022)。

1.3儀器7900HT熒光定量PCR儀(Applied Biosystems公司)；Infinite M200 Pro多功能酶標(biāo)儀(TECAN公司)；ChemiDoc XRS+凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)PC12 細(xì)胞接種在25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入含10%胎牛血清、1%青霉素、鏈霉素的改良型RPMI 1640培養(yǎng)液，置于37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、傳代。

2.2實(shí)驗(yàn)分組與處理待PC12細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，將其分為5組：正常對(duì)照組(Normal)、模型組(Model)、CoCl2+0.1 μmol ·L-1紅景天苷組、CoCl2+1 μmol ·L-1紅景天苷組、CoCl2+10 μmol ·L-1紅景天苷組。待細(xì)胞長(zhǎng)到80%后，吸出舊培養(yǎng)基，用PBS洗1遍，模型組和給藥組中加入含CoCl2的培養(yǎng)基(CoCl2的終濃度為200 μmol·L-1)。之后給藥組立即加入相應(yīng)濃度的紅景天苷，正常對(duì)照組加入相同的溶劑，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集樣品待測(cè)。

2.3caspase-3活性的檢測(cè)PC12細(xì)胞以2×108·L-1的密度接種于96孔板，每孔加入100 μL，待細(xì)胞長(zhǎng)到80%后，PBS洗1遍，經(jīng)CoCl2造模、紅景天苷給藥處理細(xì)胞48 h后，預(yù)冷的PBS漂洗1遍，加入25 μL試劑盒中的細(xì)胞裂解液，冰上靜置5 min，再加入200 μL Ac-DEVD-AMC( caspase-3四肽熒光底物)，于37 ℃ 避光孵育1 h后，在多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)380 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為420 nm，單位以相對(duì)熒光單位(relative fluorescence units，RFU) 表示。

2.4C3a受體拮抗劑實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)分組：正常組(Normal)、正常+紅景天苷(1 μmol·L-1)組、模型組(Model)、模型+紅景天苷(1 μmol·L-1)組、模型+C3aRA(50 nmol·L-1)組、模型+C3aRA(50 nmol·L-1)+紅景天苷(1 μmol·L-1)組。以2×108·L-1的細(xì)胞密度接種PC12細(xì)胞至24孔培養(yǎng)板中，每孔中加入不含抗生素的培養(yǎng)基0.5 mL，按照分組造模、給藥后，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集樣品，檢測(cè)Egr4、Egr1 mRNA表達(dá)及caspase-3活性。

2.5Egr4siRNA干擾實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)分組：正常組(Normal)、模型組(Model)、siRNA陰性對(duì)照組(Negative control)、紅景天苷組(Model+Salidroside組，紅景天苷終濃度為1 μmol·L-1)、Egr4 siRNA組(Model+Egr4 siRNA組，Egr4 siRNA終濃度為50 nmol·L-1)、Egr4 siRNA+紅景天苷組(Model+Egr4 siRNA+ Salidroside組，Egr4 siRNA終濃度為50 nmol·L-1，紅景天苷終濃度為1 μmol·L-1)。轉(zhuǎn)染前24 h，以2×108·L-1的細(xì)胞密度接種PC12細(xì)胞至24孔培養(yǎng)板中，每孔加入不含抗生素的培養(yǎng)基0.5 mL，使轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞密度能夠達(dá)到30%～50%匯合度。按照分組造模給藥，其中siRNA組加入siRNA-lipofectamineTM2000(lipo2000)混合液混勻；作用6 h后，移去含有siRNA-lipo2000混合液的培養(yǎng)基，更換新鮮的培養(yǎng)基，且同時(shí)給予紅景天苷(終濃度1 μmol·L-1)，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集樣品，檢測(cè)C3 mRNA表達(dá)，Egr4、Bax、Bcl-xl蛋白表達(dá)及caspase-3活性。

2.6Westernblot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)提取細(xì)胞總蛋白，按照SDS-PAGE凝膠配制試劑盒說(shuō)明書，配制合適濃度的分離膠。上樣，電泳至藍(lán)色帶剛好跑到凝膠底部時(shí)終止電泳。轉(zhuǎn)膜成功后TBS洗1遍，把PVDF膜浸泡在封閉液中，置于搖床上室溫封閉2 h。加入一抗Egr1 (1 ∶800)、Egr4(1 ∶600)、C3(1 ∶600)、β-actin(1 ∶3 000)，4 ℃孵育過夜。二抗室溫孵育2 h，PVDF膜用TBS洗滌(10 min×3次)，顯影。

2.7qPCR法檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，熒光定量PCR檢測(cè)各基因的表達(dá)。PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，參照GenBank中大鼠Egr1、Egr4、C3的引物序列，Egr1引物上游序列5′-AAAATGGAATCTCTACGAAGGTCA-3′，下游序列5′-AGTCGCAGGTCAATGAAGAAGTC-3′，PCR擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為128 bp；Egr4引物上游序列5′-AAGCTGGAGCAGGAAGAGGTTG-3′，下游序列5′-GCAGGGAGGAGGTTTTGGATAG-3′，PCR擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為161 bp；C3引物上游序列5′-AAAATGGAATCTCTACGAAGGTCA-3′，下游序列5′-AGTCGCAGGTCAATGAAGAAGTC-3′，PCR擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為128 bp。

3 結(jié)果

3.1紅景天苷對(duì)PC12細(xì)胞低氧損傷后caspase-3活性的影響如Fig 1所示，200 μmol·L-1CoCl2處理PC12細(xì)胞48 h后，與正常組比較，模型組中caspase-3活性明顯升高；經(jīng)不同濃度紅景天苷處理后，細(xì)胞caspase-3活性明顯下降，且呈劑量依賴性，10 μmol·L-1紅景天苷作用的效果最好。

3.2紅景天苷對(duì)PC12細(xì)胞低氧損傷后C3蛋白表達(dá)的影響如Fig 2所示，與正常組比較，模型組中C3蛋白高表達(dá)，經(jīng)不同濃度紅景天苷作用后，C3蛋白表達(dá)降低，且隨劑量的遞增，條帶的表達(dá)減弱。

3.3紅景天苷對(duì)PC12細(xì)胞低氧損傷后Egr4、Egr1蛋白表達(dá)的影響與正常組比較，模型組中Egr4、Egr1蛋白表達(dá)降低，經(jīng)不同濃度紅景天苷作用后，Egr4、Egr1蛋白表達(dá)增加(Fig 3)。

Fig 1 Effect of salidroside on activity of caspase-3 of PC12 after CoCl2-induced hypoxia injury n=6)

*P<0.05,**P<0.01vsmodel

Fig 2 Effect of salidroside on C3 protein expression of PC12 after CoCl2-induced hypoxia injury n=6)

**P<0.01vsmodel

3.4C3aRA對(duì)PC12細(xì)胞低氧損傷后caspase-3活性、Egr4、Egr1的影響PC12細(xì)胞低氧損傷模型經(jīng)C3aRA作用后，caspase-3活性降低，Egr4、Egr1 mRNA表達(dá)增加，與紅景天苷的作用沒有明顯差異(Tab 1)。這些結(jié)果表明，C3aRA對(duì)Egr4具有調(diào)控作用，進(jìn)而對(duì)PC12細(xì)胞具有保護(hù)作用。

3.5Egr4siRNA在PC12細(xì)胞低氧損傷后對(duì)caspase-3活性、C3、Egr4、Bax、Bcl-xl的影響siRNA干擾PC12細(xì)胞低氧損傷模型中Egr4的表達(dá)后，導(dǎo)致caspase-3活性升高，Bax蛋白增加，Bcl-xl蛋白降低；經(jīng)紅景天苷作用后，能逆轉(zhuǎn)Egr4 siRNA所引起的基因表達(dá)的變化，但對(duì)C3沒有作用(Fig 4、5)。

Tab 1 Effect of C3aRA on activity of caspase-3, Egr4 and Egr1 mRNA expression of PC12 cells after CoCl2-induced hypoxia injury (fold of normal) n=6)

**P<0.01vsmodel

Fig 3 Effect of salidroside on Egr4 and Egr1 protein expression of PC12 cells after CoCl2-induced hypoxia injury n=6)

*P<0.05,**P<0.01vsmodel

這些結(jié)果表明，Egr4對(duì)C3沒有調(diào)控作用，但紅景天苷能夠通過調(diào)控Egr4，進(jìn)而對(duì)PC12細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。

4 討論

CoCl2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞化學(xué)性低氧損傷模型，常用于神經(jīng)細(xì)胞缺氧的體外研究。CoCl2能夠誘導(dǎo)一些種類細(xì)胞里的HIF-1的表達(dá)，因此，可以作為PC12、HepG2等細(xì)胞株的化學(xué)性低氧模擬劑[7-8]。PC12細(xì)胞來(lái)源于鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤，具有神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)特征與功能，廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究[9-11]。CoCl2誘導(dǎo)的PC12化學(xué)低氧損傷模型能夠模擬體內(nèi)腦缺氧情況，是體外研究神經(jīng)細(xì)胞缺氧的理想模型。本研究采用CoCl2誘導(dǎo)PC12化學(xué)性缺氧損傷發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組的Bax蛋白表達(dá)增加，Bcl-xl蛋白表達(dá)降低，caspase-3活性升高，經(jīng)紅景天苷作用后，能夠逆轉(zhuǎn)Bax、Bcl-xl蛋白的表達(dá)，以及caspase-3活性，表明紅景天苷能抑制PC12細(xì)胞因低氧損傷而導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。

Fig 4 Effect of Egr4 siRNA on Egr4 protein expression(A) and C3 mRNA expression(B) of PC12 cells after CoCl2-induced hypoxia injury n=6)

NC: Negative control; Egr4 siRNA: Model+Egr4 siRNA; Sal: Model+Salidroside; Egr4 siRNA+Sal: Model+Egr4 siRNA+ Salidroside.*P<0.05,**P<0.01vsmodel;##P<0.01vsEgr4 siRNA.

Egr4是與神經(jīng)突觸可塑性相關(guān)的基因，本研究發(fā)現(xiàn)，Egr4 siRNA作用后，Bax蛋白表達(dá)增加，Bcl-xl表達(dá)降低，caspase-3活性升高，經(jīng)紅景天苷作用后，能夠逆轉(zhuǎn)該作用。且研究發(fā)現(xiàn)，Egr4 siRNA對(duì)C3作用不明顯。提示紅景天苷能夠促進(jìn)Egr4的表達(dá)，進(jìn)而抑制PC12細(xì)胞因低氧損傷而導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。

補(bǔ)體C3是激活補(bǔ)體系統(tǒng)4條途徑的共同樞紐，在激活促炎因子、誘發(fā)炎癥介質(zhì)釋放、溶解靶細(xì)胞中扮演關(guān)鍵的角色。活化后的補(bǔ)體C3在C3轉(zhuǎn)化酶的作用下，在蛋白水平酶解成具有過敏性毒素的C3a小片段和C3b，C3a進(jìn)而與C3a受體結(jié)合，發(fā)揮過敏性毒素的作用，導(dǎo)致細(xì)胞破壞、溶解[13-14]。本研究通過使用C3aRA阻斷C3a/C3aR的結(jié)合。使用C3aRA后，PC12細(xì)胞的caspase-3活性降低，與紅景天苷作用相似，提示紅景天苷通過抑制補(bǔ)體C3/C3a受體，起到抗凋亡作用。且研究發(fā)現(xiàn)，拮抗C3a受體作用后，對(duì)Egr4具有調(diào)控作用。

Fig 5 Effect of Egr4 siRNA on activity of caspase-3(A), Bax and Bcl-xl protein expression(B) of PC12 cells after CoCl2-induced hypoxia injury n=6)

NC: Negative control; Egr4 siRNA: Model+Egr4 siRNA; Sal: Model+Salidroside; Egr4 siRNA+Sal: Model+Egr4 siRNA+ Salidroside.*P<0.05,**P<0.01vsmodel;#P<0.05,##P<0.01vsEgr4 siRNA.

綜上所述，本研究結(jié)果提示，紅景天苷對(duì)CoCl2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷模型具有神經(jīng)保護(hù)作用，與抑制補(bǔ)體成分C3，促進(jìn)Egrs表達(dá)，進(jìn)而抑制Bax蛋白表達(dá)及caspase-3的活性，促進(jìn)Bcl-xl表達(dá)有關(guān)。